一：本课题的目的及意义：
一直以来，纯化技术是制约蛋白质研究开发及其产业化的关键技术之一。利用各种用于构建融合基因的载体可以很容易表达出各种融合蛋白, 但蛋白质的纯化一直是非常困难的事情, 为了解决重组蛋白的纯化问题, 人们将一些亲和性标签构建到重组融合蛋白中, 以便采用亲和层析的方法来纯化重组蛋白质。融合标签技术是20 世纪末兴起的一种基因重组技术，其主要过程是利用重组DNA 技术在靶蛋白编码基因的3 端或5 端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质。表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。融合标签技术用于重组蛋白质纯化已为大量实验所证实。理论上，根据亲和纯化原理可定向设计使目标蛋白质与纯化基质之间不发生任何直接相互作用的融合标签，以避免由于这种直接相互作用造成蛋白质变性。目前已有许多不同的标签可供利用。它们利用了标签与固相配体间的相互作用，从而可从复杂的提取物中对标签融合蛋白进行选择性的结合和洗脱。目前最常用的标签是多聚组氨酸，即His 标签。该标签由6- 10个连续组氨酸组成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His 标签与其它标签相比有很多明显优势：①对金属离子如镍、钴有高度的选择性和亲和力；②与金属离子的结合不受变性剂（尿素、胍）的影响；③温和多样的洗脱条件(100～250 mmol/L 咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各种商品化介质(Ni- NTA- Agarose,Ni- IDA- Agarose)提供。另外，抗His 标签的单抗或多抗也被应用于His 融合蛋白的纯化。
1975 年,Porath 首次提出固定化金属螯合亲和层析( IMAC) ,并发展为一种有效的生化分离技术。该方法利用固定在基质上的过渡态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基的配位作用来实现对金属离子有亲和力的蛋白质分离。其中,组氨酸是与金属离子作用较强的氨基酸,含有多个组氨酸的蛋白质可在IMAC 中有效保留,故多聚组氨酸已成为最常用的蛋白质纯化标签。
综合以上情况，因此构建多聚组氨酸标签融合蛋白，采用固定金属离子亲和层析进行纯化，是一种高效的蛋白质纯化策略。
花生是一种重要的食物过敏原，属于世界粮农组织(FAO)报告的八大过敏食物之一。目前国际免疫联合会命名小组委员会认可的花生过敏原有11 种，其中Ara h2 是一种主要的花生过敏原, 超过90%的花生过敏患者血清IgE 都能够识别Ara h2。Ara h 2是分子质量为17～20kD 同种异型蛋白，约占花生蛋白总量的10%，是花生中致敏性最强的组分之一。本课题实验研究的目的是经过亲和纯化获得纯度较高的Ara h2。通过对其的纯化与分析，可为Ara h 2 进一步相关研究提供标准化的实验材料。为今后利用重组过敏原蛋白进行临床诊断和治疗及分子疫苗的开发打下了基础。
二：主要研究内容与拟解决的主要问题：
1：研究的基本内容：
本课题主要是对一种在哺乳细胞瞬时转染表达系统中分泌表达的带6个组氨酸标签的蛋白进行纯化和分析。收集细胞转染第六天的培养基进行离心和过滤处理，通过亲和层析技术对蛋白进行纯化，收集纯化后蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析，对成功纯化的蛋白进行脱盐处理并分析。
2：拟解决的主要问题：
（1）：采用镍亲和层析的方法纯化本课题所需要的蛋白质
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