实验背景：抗苗勒氏管激素（Anti-Mullerian hormone）又称为苗勒氏管抑制物 (Mllerian inhibiting substance , MIS) , 是一种以多肽形式存在的细胞因子, 属于转化生长因子beta;(TGF-beta;)超家族中的一员。1947年Jost首次发现其在睾丸中表达, 由睾丸的Sertoli细胞分泌,与缪勒氏管退化有关。直到1986 年Cate克隆并分离出人类和牛的AMH基因，AMH 的生物学效应、相关调控机制等方面研究才得以迅速发展。AMH 在哺乳动物、鸟类、爬行类和硬骨鱼类的性腺发育过程中都起到了重要作用。哺乳动物精巢中支持细胞产生的AMH能够指示缪勒氏管的退化, 同时, 精巢中的睾丸间质细胞产生睾酮, 刺激中肾管分化成附睾、输精管和精囊；在雌性中, 由于AMH 的缺失, 缪勒氏管分化成输卵管、子宫和阴道上缘。AMH基因能够编码AMH蛋白。它能够抑制副中肾管在男性胚胎中的发育。自胚胎第5周，胚胎体腔背部，肠系膜两侧的体腔形成尿生殖嵴，外侧为中肾，内侧为生殖嵴，是性腺发生的始基。无论男女在生殖嵴外侧，都有中肾管和副中肾管。当生殖腺分化时，这两对管道发生不同演变，在女性，中肾管退化成遗迹，副中肾管发育成女性内生殖器官。尽管AMH受体在男女胎儿中都会表达，但AMH表达仅限于男性支持细胞。AMH的表达是由男性支持细胞中的SOX9激活，并会导致副中肾管的不可逆退化。AMH在胚胎发育的特定时段对于性别分化至关重要。
实验原理：
1.目的基因克隆：实现某一目的基因的表达，首先要做的就是通过目的基因的克隆得到该基因。目的基因的克隆方法很多，一般我们可以采取的有三种：一是建立基因文库并筛选，包括建立基因组文库和cDNA文库；二是通过PCR（polymerase chain reaction 聚合酶链反应）扩增得到；三是通过人工化学方法合成。本课题中采用PCR 扩增，此方法较之其他两者更加简便，且也可保证得到目的基因的克隆。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单链，低温（经常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
2.表达载体的构建：表达载体的构建主要有真核生物表达系统和原核生物表达系统。前者主要采用的是酵母表达系统，适用于蛋白质需要进行修饰（如甲基化，糖基化）才具有活性的蛋白表达；后者主要采用的是大肠杆菌表达系统，表达蛋白不具备任何修饰，故而一般用于无需修饰活化的蛋白。大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,本次实验采用的即是大肠杆菌表达系统构建载体。
（1）表达载体的选择：根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如lambda;PL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2 gt;Fe2 gt;Zn2 gt;Ni2 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2 是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。本实验使用His标签。
（2）宿主菌的选择重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5alpha;，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlmu;e等recA和endA型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主：
BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，lambda;PL，cspA等作为启动子的载体。
BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lacMu;V5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。
BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和gor双突变。拥有trxB和gor突变的菌株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。
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