开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 课题背景
自1975年，Georg Kohler与Cesar Milstein在《自然》杂志上发表了有关“分泌预定特异性抗体融合细胞的持续培养” 的著名论文， 贯彻自然杂交技术的思路成功地研制出了单克隆抗体。 由于单抗纯度高、 均一性强并又具有抗体本身的特异性， 自其问世后， 就被广泛应用到检测医学确诊与肿瘤、 自身免疫性疾病和感染性疾病治疗上。 特别是在疾病治疗方面， 单抗的特异性能够极大地发挥靶向作用， 大大降低了药物副作用、 提高了药效。在2018年全球药物销量排行榜前十中有五个是单抗药物，而销售额第一位的就是阿达木单抗。阿达木为抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体，是人单克隆D2E7重链和轻链经二硫键结合的二聚物。主要用于类风湿关节炎、强直性脊柱炎的治疗，其作用机理为特异性地与TNF-alpha;结合并阻断其与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用。
随着细胞大规模培养技术的发展，工业化细胞培养液体积可达数千升到1 万升以上，抗体表达量可达 5 g/L 以上，下游纯化层析成为限制单抗产量的关键步骤。
阿达木层析工艺共有以下6个步骤：
- 亲和层析
本过程层析填料介质为Protein A。Protein A 是从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的一种蛋白质，它能够特异性地与哺乳动物 IgG 的 Fc 区域结合。蛋白 A 填料在单抗纯化工艺中具有载量高，处理速度快等众多优势，非常适合用于单抗纯化的捕获阶段。其具体优势包括：①特异性好，一步纯化所得抗体的纯度大于 95%；②具有浓缩的作用，洗脱液的抗体浓度高于 10 g/L，大大减少了后续纯化溶液处理体积；③适用于所有人源的（除 IgG3）抗体和Fc 融合蛋白。但同时也存在一定的局限性：①Protein A 凝胶价格昂贵，比普通色谱介质的价格高数倍；②低 pH 条件下洗脱，抗体分子容易形成聚集体和沉淀；③Protein A 配基脱落，需在后续纯化中去除。可以采用以下策略解决上述问题：①适当提高抗体洗脱缓冲液的 pH 值，更有利于重组单抗的稳定；②在洗脱缓冲液中加入一些蛋白稳定剂，如精氨酸、尿素等，能够有效抑制聚集体的形成；③在低温条件下进行层析操作，也可降低重组单抗的聚集。
- 低ph孵育灭活
通过将 Protein A 洗脱液的 pH 调节至低于 3.8 并孵育一定时间，可以有效地去除脂质包膜病毒。但是将重组单抗溶液调至低 pH 容易导致重组单抗失活及聚集。经研究表明，在溶液中加入 0.3 ~ 2 mol/L 的精氨酸，可以达到稳定重组单抗及减少聚集的作用。在阿达木层析工艺中使用枸橼酸与氨丁三醇来调节pH.
- 阴离子交换层析
阴离子交换层析一般采用流穿模式进行纯化，去除残留的 DNA、内毒素及聚合物。在流穿模式中，用脱盐或者稀释的方式将溶液的盐离子浓度调低，使重组单抗流穿而微量杂质保留在柱子上，以此达到去除内毒素和 DNA 的目的。
- 阳离子交换层析
阳离子交换层析通常采用吸附-洗脱模式，主要的目的在于去除 DNA、宿主细胞蛋白质、脱落的亲和配基和内毒素。在洗脱过程中，杂质与阳离子介质结合力弱而被除去，而重组单抗则吸附在填料上，再通过改变 pH 或者增加盐离子浓度将目的蛋白洗脱下来。
- 疏水层析
疏水作用层析是采用高盐上样，低盐洗脱模式，通过强离子浓度变化进行目的蛋白与杂质之间的分离，能有效除去宿主细胞蛋白、DNA 和病毒等杂质。
- 除病毒过滤
低pH孵育可以有效去除脂质包膜病毒，而非包膜病毒如鼠细小病毒由于具有较高的化学溶液耐受性，必须采用物理的方法来去除，其中吸附法和小孔径膜过滤法均被广泛应用。病毒过滤既可以采用切向流过滤，也可以采用盲端过滤，但采用切向流过滤往往导致样品浓度过低，因此盲端过滤法更为合适。病毒过滤器分为过滤逆转录病毒级别（lt; 50 nm）和过滤细小病毒级别（lt; 20 nm）。病毒过滤的步骤可以设计在精制过程中的任意步骤之后，通常在恒定的压力下进行。由于病毒过滤器的孔径特别小，尤其是细小病毒级别的过滤器，在样品含有聚集体情况下很容易造成堵塞，必须增加过滤的操作压力来解决这一问题。在阿达木层析工艺中选用的除病毒过滤器孔径为0.1um,除病毒过滤膜孔径为20nm。
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