一、研究背景
MDM2 基因是一原癌基因, 编码蛋白总分子量为90 kD, 因mRNA 的不同剪切可形成多种不同分子量的变异体, 如p57、p64、p85、p 90 等。MDM2 是p53 调控网络中的下游基因, 作为p53 的重要调节因子, 参与细胞生长抑制、凋亡、细胞周期调控等过程。MDM2 与p53 构成降解-反式激活循环通路。MDM2 具有泛素化-蛋白酶降解p53 的功能, 而p53反式激活因子又可诱导MDM2, 消除反馈循环。p53-MDM2 模式是癌蛋白-抑癌蛋白的典型作用模式。p53 的2 个自动反馈循环, 即B-连环蛋白和蛋白激酶B( PKB) 循环, 其关键点在于p53 与MDM2的相互作用。MDM2 能使p53 钝化并经蛋白酶降解, B-连环蛋白使MDM2 失活, 导致p53 堆积; 而p53 反过来又反馈抑制B-连环蛋白。PKB 能阻断p53 活化, 激活MDM2, 而p53 又可使PKB 减少。最终结果取决于各种组分之间的平衡及其他信号途径的调节。MDM2 基因突变或表达异常将导致平衡的破坏, 可能与细胞转化和肿瘤发生有关。
抑癌基因的失活和原癌基因的异常激活会导致恶性肿瘤的发生,而是研究最为广泛的抑癌基因,它在抑制肿瘤方面发挥着重要作用。P53作为转录因子能够激活下游众多具有不同生物学功能的靶基因的转录,因而具有广泛的生物学功能,包括促进细胞周期阻滞、DNA修复和细胞凋亡等。在正常情况下,p53处于被抑制状态,这是由于E3泛素连接酶小鼠双微体2 (Murine double minute 2, MDM2)能够抑制其转录活性并介导其发生泛素化降解。而同时MDM2又是p53蛋白调控的靶基因,因此两者可以形成MDM2-p53负反馈环路。细胞在应答不同的胁迫刺激时,会有不同的信号因子调控这个负反馈环路。DNA损伤会激活ATM (Ataxia telangiectasia mutated)/ATR (ATM Rad3 related kinase)等激酶从而介导 DDR (DNA damage response)信号通路;病毒侵染或癌基因过量表达会诱导肿瘤抑制因子ARF (Alternating reading frame)表达,进而介导ARF-MDM2-p53信号通路;核糖体合成受阻引起“核糖体胁迫”能够通过核糖体蛋白(Ribosomalproteins, RPs)介导RPs-MDM2-p53信号通路,细胞主要通过以上三条信号通路激活p53。
二、研究意义
MDM2 在体内起到原癌蛋白的作用, 与p53 构成反馈体系, 并与其他信号转导途径一起形成调控网络, 参与细胞各种生物进程, 并与许多肿瘤的发生、发展密切相关, 有望成为基因治疗的有效靶基因。泛素化介导的蛋白质降解在细胞周期调控、DNA 损伤、细胞生长与免疫反应等多种信号通路中发挥重要作用, 泛素化与去泛素化过程异常与肿瘤的发生密切相关。其中, 泛素连接酶决定底物识别的特异性, 在泛素化系中最为关键, 因此对泛素连接酶活性及功能调控的深入研究对理解泛素化降解的机制、诊治由泛素系统紊乱而引起的各种疾病具有重要意义。而 MDM2 作为联系肿瘤发生与泛素蛋白酶体系统的重要蛋白, 无疑是未来相关药物研发的富有前景的靶标之一, 未来若干年内对MDM2活性及稳定性调控的研究仍将是相关领域的热点之一。
三、课题研究内容
- MDM2原核表达载体的构建
PCR扩增含StuI、EcoRI酶切位点的MDM2基因序列，将PCR产物连接到TA克隆载体，转化到大肠杆菌DH5alpha;感受态细胞之后进行测序验证，测序结果与MDM2基因进行序列比对结果无误后，采用StuI、EcoRI双酶切PCR扩增的MDM2序列及pGEX-4T-2表达载体，将目的片段与表达载体连接后转入DH5alpha;，测序分析确定序列没有突变，并且目的基因插入位点前后接头正确。
- MDM2蛋白的表达
提取pGEX-4T-2-MDM2质粒，转化入大肠杆菌CK600K感受态细胞中表达EMDM2蛋白。于LB液体培养基中37℃、220rpm培养12h获得种子液，将种子液以1:100（ml）的比例接种于200ml液体LB培养基中，至OD600=0.5，加入L-脯氨酸（2.3g/L）、甜菜碱（0.6g/L）和NaCl（4M/L），降温至20℃，180rpm培养至OD600=0.8，加入20ul的IPTG（1M）诱导，过夜。
- MDM2蛋白的纯化
收集诱导后的菌体，低温离心弃上清。用Bing buffer悬浮菌体，低温高压破碎细胞，离心取上清通过GSH琼脂糖柱后，采用优化的蛋白纯化条件，最终用还原型GSH洗脱即可得到MDM2-GST融合蛋白粗品。SDS-PAGE 电泳检测各洗脱管蛋白含量。合并含有目的蛋白的收集管，超滤浓缩。thrombin酶切去GST，去除标签。浓缩后冻存于-80℃冰箱。
参考文献：
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