转录因子GLi1突变体的构建及在细胞内的表达鉴定
一、研究背景
GLi1蛋白是Hedgehog/GLi1信号转导通路的下游转录调控因子之一，其表达水平增高是Hedgehog/GLi1信号转导通路处于激活状态的标志。在人的生长发育过程中，Hedgehog/GLi1信号传导通路是胚胎发育过程中对组织器官的分化以及成熟具有重要作用的信号转导通路[1]。GLi1蛋白是由Kinzler等人于1987年发现的，由于其在脑神经胶质瘤中的扩增50个折叠而得名[2]，同时该基因也在最初的肿瘤细胞里面也是高表达的,运用逆转录得出其DNA经过测序发现GLi1蛋白含有5个锌脂结构，而且都属于Krupple锌脂蛋白家族[3]。近来研究表明该信号通路的异常也与一些肿瘤的发生、发展、复发、转移密切相关。Hedgehog/GLi1信号最终传入细胞核，由核转录因子GLi1结合基因启动子，促进其下游基因的表达，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,从而表现出促进肿瘤的效应。 目前研究发现， 在多种肿瘤组织中存在着GLi1异常高表达，提示在这些肿瘤组织中存在着Hedgehog/GLi1信号通路的异常激活[4]。
例如，在神经胶质瘤当中，Hedgehog/GLi1信号通路一直处于一种调节紊乱的异常激活状态[5]。若是Hedgehog/GLi1信号通路的调节紊乱，在胚胎期会造成生物个体神经系统的发育障碍和畸形，在已成熟的生物个体中Hedgehog/GLi1信号通路的调节紊乱将会导致肿瘤的发生[6]。
近年来的研究表明，在很多的人类恶性肿瘤疾病中（如基底细胞癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，前列腺癌，胃癌,乳腺癌以及肿瘤中血管的生成等）Hedgehog/GLi1通路都是呈现出异常活化的状态，并且对肿瘤的发生及发生后的肿瘤组织的生长和恶性生物学特性的维持起着重要的作用[7]。研究表明GLi1转录因子主要是通过以下几个机制直接诱导肿瘤的发生：①诱导G1/S细胞周期调节细胞蛋白的表达，从而促进细胞的增殖；②直接诱导抗凋亡因子Bcl2的表达从而抑制细胞的凋亡；③直接激活可促进上皮组织向间质转化的因子的转录，以提高肿瘤的侵略性。同时，人们在研究Hedgehog/GLi1信号转导通路与肿瘤之间的关系时发现，特异性的抑制Hedgehog/GLi1信号转导通路，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖以及向其他器官侵袭转移的能力。因此Hedgehog/GLi1信号转导通路被认为是一条比较理想的可以作为肿瘤靶向治疗的信号途径[8-9]。针对Hedgehog/GLi1信号转导通路的抑制性研究工作方兴未艾，逐渐成为国际的研究热点。
二、研究意义
关于GLi1蛋白于肿瘤中的作用目前已经研究得比较透彻，在多种肿瘤组织中存在着GLi1异常高表达，提示在这些肿瘤组织中存在着Hedgehog/GLi1信号通路的异常激活。因此如何降低GLi1蛋白在这些组织中的含量，抑制Hedgehog/GLi1信号转导通路的异常，可能提供一种有效的的治疗肿瘤的手段，降低肿瘤细胞中GLi1蛋白的方法不外乎有两种：一种是抑制GLi1蛋白的产生；一种是促进GLi1蛋白的快速降解。本实验主要研究思路属于第二种方法，而蛋白的降解通常需要经过泛素化修饰，从而进入降解的过程，因此本实验的研究方法，在于确定GLi1蛋白与泛素的结合位点，利用可能存在的结合位点，通过定点突变技术来确定GLi1蛋白的泛素化修饰位点，从而为研究其快速降解提供依据。
根据文献报道得出GLi1蛋白泛素化位点位于C端的第755位之后的氨基酸，根据其氨基酸的排列和种类可以确定GLi1蛋白的929、960、1003位上的赖氨酸可能是与泛素结合的位点。本实验采用重叠PCR技术，定点突变扩增GLi1蛋白C端的第 929、 960 、1003的位点上的赖氨酸基因(将互补于赖氨酸密码子AAA/AAG 的基因TTT/TTC突变成互补于丙氨酸密码子 GCA的基因CGT)，构建其组合突变体。从而使得GLi1上第使其泛素化位点发生改变，从而确定GLi1蛋白的泛素化修饰位点。
三、课题研究内容
1、Gli1突变体构建：设计互补的含突变位点的引物（将赖氨酸密码子AAA/AAG 突变成丙氨酸密码子 GCA）。即以实验室之前构建好的含有K929A、K960A、K1003A突变位点的pCDNA3.1( )-myc-Gli1*-his全长基因分别为模板，用 Primer Premier 5.0 软件设计一对分别含有酶切位点HindIII和XbaI的上、下游引物以及含突变位点的5对互补突变引物，在原有突变位点的基础上构建组合突变体，命名突变体为K929A-K960A、K960A-K1003A、K929A-K1003A、K929A-K960A-K1003A。PCR 扩增分别获得带有突变的上下游片段，再利用重叠 PCR 将小片段连接，从而获得突变目的基因。双酶切突变片段和载体，分别切胶回收连接，转化DH5alpha;培养 16~18h 后挑取单菌落，加入含 5ml 液体 LB 培养基的试管中过夜培养，提取质粒送公司测序验证。
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