EPAC1抑制剂的高通量筛选方法的探索文献综述

 2023-01-09 17:57:08

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

EPAC1抑制剂的高通量筛选方法的探索

  1. 研究背景

EPAC蛋白研究概况： Johan de Rooij等于1998年发现了一种新的能直接被cAMP活化的交换蛋白（EPAC）作为细胞内cAMP受体家族的新成员,使人们对cAMP信号通路中的相关分子与途径有了革命性的认识[1]。Epac 蛋白的主要功能为Rap 蛋白的鸟苷酸交换因子，它能够特异性结合Rap，并将Rap 结合的无活性的GDP 置换为有活性的GTP，从而激活Rap，进而使Rap 发挥重要信号分子作用。近年的研究工作认为，Epac-Rap1 是新的cAMP 信号通路中的关键分子，可以在机体中发挥广泛且重要的生理效应。广泛的研究已经表明，cAMP信号网络是更加复杂和动态的尽可能多的cAMP有关的细胞过程，先前认为是由蛋白激酶A的控制，被发现也由EPAC蛋白介导。在生理和病理条件下，cAMP介导的信号调节一系列重要生物过程。在多细胞真核生物中，cAMP的作用是由两个普遍表达的细胞内cAMP受体所转导。经典的蛋白激酶A/ cAMP依赖性蛋白激酶（PKA/ CAPK）和最近发现的能直接被cAMP活化的交换蛋白/ cAMP调节鸟嘌呤核苷酸交换因子（EPAC/ cAMP的GEF）[2,3]。因为这两个PKA和EPAC被普遍表达于所有组织中，增加细胞内cAMP水平将导致两个PKA和EPAC的活化。cAMP的净生理效应意味着EPAC-和PKA依赖通路在空间和时间上的整合。根据它们的相对丰度，分布和定位，以及精确的蜂窝环境，这两个细胞内cAMP受体可以独立行动，会聚协同，或者彼此相对的调节一个特定的细胞功能[4]。

EPAC抑制剂：选择性药理探针，特别是抑制剂，已经成为解剖信号分子的生理功能和信号转导途径机制的有价值的工具。多年来，能选择性地激活EPAC的cAMP类似物，8-(4-chlorophenylthio) -29-O-methyladenosine-39,59-cyclic monophosphate (8-CPT-29-O-Me-cAMP/007)，和其衍生物，是基于结构/序列比对分析[5,6]开发。8-CPT-29-O-ME cAMP 对EPAC 有约100倍的选择性已成为EPAC相关的研究[5-10]一种广泛使用的工具。 8-CPT-29-O-Me cAMP类化合物的局限性包括膜通透性差和细胞潜能弱[10,11]。近日，笼形8-CPT-29-o -Me cAMP衍生物8-CPT-29-O-ME-cAMP-AM，一种具有强细胞膜通透性的衍生物已经发展[11,12]。尽管如此显著的改善，8-CPT-29-O-ME-cAMP- 相关化合物的生物应用由它们的脱靶效应抑制细胞中的磷酸二酯酶（PDE）所限制，这将导致cAMP和/或cGMP升高和因此间接激活PKA，PKG和/或环核苷酸门控通道[13]。

  1. 研究意义

Epac在生理和病理中的作用已经成为重要的一个研究方向并且受到了广泛地关注。研究人员认为EPAC蛋白能调控大脑空间认知和社交能力中miR-124的转录。这将有助于科学家们更深入的了解大脑认知和社交能力的作用分子机制。疾病研究中，例如：心肌肥大病和阿尔茨海默症（AD），另外，Epac信号途径还与感染、糖尿病和慢性肺阻塞性肺病、自闭症/抑郁有着密切联系[14-18]。

到目前为止，尽管已经有许多有关EPACs作用的重要发现,但它们在cAMP介导的信号在生理功能上的的更深入的了解由缺少EPAC特异性拮抗剂所阻碍。尽管EPAC在整体的cAMP介导的信号中一直是研究领域中的一个重大挑战， 但还没有EPAC特异性拮抗剂的报道，和开发的EPAC特异性药理探针去解剖生理功能。为了弥补这主要差距，我们设计了本次实验。希望研究Epac蛋白生理作用，及在特定疾病发生发展过程中的联合作用上有所突破。

  1. 研究内容
  2. 带有荧光基团的GDP类似物的选择比较

将Rap1b（1-167）与带有不同荧光基团的GDP类似物混合孵育后作为筛选底物。候选的两种带荧光基团的GDP类似物分别为MANT-GDP和BODIPY-GDP。荧光强度的增强有赖于与Rap1b的结合。结合在Rap1b上的带有荧光基团的GDP类似物将被后续加入的GDP所置换，导致荧光强度的减弱。比较两种荧光基团的GDP类似物在检测方法中的信噪比，选择最佳的类似物用于后期的高通量筛选。

  1. 确定实验中蛋白及化合物的浓度

根据文献参考，首先根据这样的浓度进行实验：将终浓度为500nM的Rap1b(1-167).BODIPY-GDPMANT-GDP,200ml的EPAC1a(溶于50mM Tris-HCl ,Ph7.5,50mM NaCl,5mM MgCl2,1mM DTT)及50uMGDP加入到half-area 96孔板，采用Spectramax M2 Plate Reader检测器检测激发/发射波长为485/515的荧光强度变化
由于不同批次纯化的EPAC1a活力会有所差别，因此将再根据具体的实验数据对各浓度进行一定的调整。

参考文献：

  1. Bos JL，Zwartkruis FJ ，Verheijen MH，et al.Epac is a Rap1 guanine-nucleotide-exchanger factor directly activated by cyclic AMP .Nature，1998，396:474-477

2. de Rooij J, Zwartkruis FJ, Verheijen MH, Cool RH, Nijman SM, et al. (1998) Epac is a Rap1 guanine-nucleotide-exchange factor directly activated by cyclic AMP. Nature 396: 474–477.

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