【文献综述】
1 实验背景
肿瘤目前已是严重威胁人类的生命健康的常见病、多发病。全球每年新发病人数已超过1000万,而死亡人数也上升到了700万以上。而且近年来由于环境污染以及不良的生活习惯,使得肿瘤尤其是恶性肿瘤的发病率不仅逐年上升,同时还逐渐呈现年轻化的趋势。因此,对肿瘤的防治工作已经非常迫切。 抗肿瘤药物是目前恶性肿瘤的主要治疗手段。但由于目前临床应用的抗肿瘤药物存在诸多问题(水溶性差、毒副作用严重以及易产生获得性耐药性),不能满足临床治疗的需要。因此,新型的抗肿瘤药物的研究开发成为药物研究的重点领域之一,其中微管蛋白抑制剂又是目前抗肿瘤药物研究的热点方向。
微管(microtubulel是真核细胞的重要组分,也是重要的抗肿瘤药物作用靶标。现有研究表明,微管蛋白(tubulin)中存在三个主要的药物结合位点:紫杉醇结合位点(Taxol site)、长春碱结合位点(Vinblastine site)以及秋水仙碱结合位点(Colchicinesite)。但在这三个位点中,秋水仙碱位点由于自身结合腔的体积较小,有利于小分子抗肿瘤抑制剂的研究。 本课题以微管蛋白中的秋水仙碱结合位点为靶标,分析研究结合位点的结构性质,并模拟其与抑制剂的结合,确定各亚区域的性质、关键作用残基以及潜在的结合部位;从抑制剂结构中的共有基团入手,逐步扩充共有基团的性质,从而假设了抑制剂的结构模板。再从活性构象出发并结合已有的构效关系研究,提出抑制剂的三维药效团模型以及影响活性的部分结构因素。在此基础上,开展新型微管抑制剂的设计、合成、结构改造以及体外活性研究。
一.微管蛋白中秋水仙碱药物结合位点的研究 1.结合位点的性质 采用多拷贝同时搜寻(MCSS)方法,以不同性质的官能团为探针对结合位点进行分析。根据官能团的空间分布位置,将结合位点分为三个疏水口袋(Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ)以及三个极性区域(Ⅳ,Ⅴ和Ⅵ)。疏水口袋Ⅰ和Ⅱ为主要的疏水基团分布区,但是在Ⅱ中芳香性基团的分布在能量上占优且优势构象为垂直的插入其中。Ⅲ位于结合位点的底部,受其空间所限,只能接受体积较小的脂肪族基团且能量较高。极性基团主要分布在极性区域Ⅳ和Ⅴ中,前者中氢键受体、供体基团无明显差别,但后者中氢键受体基团分布的能量与数量更有优势。Ⅵ则位于Ⅰ和Ⅲ之间,极性基团有分布但能量较高。此外,beta;-Cys241的-SH因为带有微弱的极性,因而附近可以分布两种不同的基团,如芳香性和氢键受体基团。属于极性区域Ⅳ中alpha;-Ser178的骨架O、alpha;-Thr181的骨架-NH,以及位于Ⅴ中的beta;-Ala250～Leu255间的骨架-NH的周围均富集了不少极性基团的分布,提示了这些残基的重要性。 对结合位点的静电势研究表明,整个结合位点主要表现为电中性,但是在Ⅰ的底部与Ⅵ具有负电特性,而在极性区域Ⅳ和Ⅴ却为正电特性。这一分析,与MCSS的研究结果相符,且也同晶体结构中Colchicine的构象较为匹配。而呈负电的和正电的区域,却没有被已有抑制剂占据,因而可以作为潜在的部位参与结合。 2.蛋白与抑制剂的结合模式研究 采用AutoDock软件,模拟了蛋白与抑制剂的结合。按照结合能量以及出现的次数,确定抑制剂的结合构象。结果表明,抑制剂主要通过与疏水口袋Ⅰ和Ⅱ间的疏水作用以及与极性区域Ⅳ间的氢键作用而与蛋白结合。抑制剂结构中体积较大且非平面的疏水部分(如三甲氧基苯环)位于疏水口袋Ⅰ中,其中的氢键受体原子(如O)或者苯环与beta;-Cys241的-SH存在极性作用(氢键或者阳离子-pi;作用)。平面的疏水部分则垂直的姿态插入Ⅱ中,其中的疏水侧链伸向Ⅱ的内部,而氢键供体原子或者受体原子,分别与alpha;-Ser178或者alpha;-Thr181形成氢键。此外,抑制剂中位于Ⅰ和Ⅱ二者之间的结构部分上的O原子(如=O)的空间位置比较相似,均指向loop区的beta;-Ala250的骨架-NH。 对AutoDock对接得到的抑制剂结合构象又进行了Affinity的柔性对接方法考察结合位点中残基的构象改变情况。结果表明:主要的结合残基beta;-Cys241、beta;-Leu248、alpha;-Thr179、alpha;-Val181以及beta;-Asn352侧链的构象改变较大,可能是因为随着周围配体中的基团位置的改变而产生相应的变化。但是结合位点中的其余残基的构象均未发生明显改变。 3.确定关键作用残基以及潜在药物结合部位 根据MCSS中官能团的分布位置与能量,提示了极性区域Ⅰ中的beta;-Cys241、Ⅳ中的alpha;-Scr178和alpha;-Thr181,以及Ⅴ中的beta;-Ala250～Leu255等残基可能具有一定的重要性。在抑制剂的结合构象中,beta;-Cys241、Ⅳ中alpha;-Ser178和alpha;-Thr181均以氢键的形式参与了结合。同时,参考已有的构效关系研究,失去与beta;-Cys241或者alpha;-Ser178以及alpha;-Thr181间的极性作用,对活性具有一定的负面影响,因而明确的指出它们为关键的结合残基。 由于Ⅴ中的beta;-Ala250～Leu255之间的骨架-NH位置集中且又有开阔的空间,而且MCSS计算中氢键受体官能团的能量较低,因而是一个比较理想的氢键供体区域。然而,对接研究表明,现有的抑制剂均未与该区域结合。
2 实验目的和意义
GZ50是经天然产物修饰获得全新化学骨架的可逆的秋水仙碱位点微观抑制剂。目前，以微观蛋白上市的一线药是紫杉醇，在临床上治疗被用于多种肿瘤适应症。最新FDA批准微管药物：Ixabepilone,Cabazittaxel,Erbulin mesylate。此外，在临床试验的小分子化合物有CA4-P（PHASE 3），MPC6827(PHASE 2)等。GZ20的课题思路是，用天然骨架去替换MPC6827的喹唑啉骨架。GZ50的体外活性，超过了紫杉醇，在不同的肿瘤株上，IC50全部在1-10nM。GZ50在耐药株MCF-7/ADR,A2780/T,HCT/T上的效果都表现非常好，IC50全部在1-30nM。药理机制证实，GZ50结合在秋水仙碱位点，和MPC6827不同的是，GZ50是可逆的微管抑制剂，一次毒性会小很多。目前采用的是GZ50枸橼酸盐给药，做成普通静脉制剂。GZ50枸橼酸盐在结肠癌C26，肺癌H460，乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR，卵巢癌A2780s和A2780/T一共六个模型中，都有非常好的肿瘤疗效，活性高于紫杉醇，毒性低于紫杉醇和MPC-6827组织分布实验中，发现GZ50有很好的肺聚积效应。
3 实验仪器、设备
本实验动物：家兔、小鼠
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