- 研究背景
多糖（polysaccharides）广泛存在于自然界中，是一类功能众多、结构复杂的生物大分子[1]。进入21世纪以来，多糖逐渐成为继遗传基因、蛋白质之后的另一个重要的生命科学研究领域。大量研究表明，多糖来源广泛，常被报道具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗氧化、抗凝血等多种药理活性[2]。因此以建立天然来源多糖的制备工艺，并对其进行结构特征鉴定，最终探索其生物活性为目的多糖研究日趋活跃起来。
多糖结构的分析是糖类成药性研究的一个重要环节，这主要源于糖结构的高度复杂性。和蛋白质、核酸相似，糖类物质的结构也有初级和高级之分，但其初级结构的“要义”相对于上述两者要丰富的多，主要表现为包括糖基种类、糖环形式、异头碳构型、糖苷键的连接位点及排列顺序以及分支等。多糖在体内的不同生化活性，都是以其结构特征为基础而表现的。因此，开展多糖结构与功能的关系即构效关系的研究十分关键。基于这个目的，将多糖降解，获得具有不同结构信息的低分子量样品片段成为多糖构效关系研究的主流方法。目前，已有很多实验证明多糖的降解片段具有与完整多糖相当或更强的活性。相应片段分子量较低，结构信息较完整，这对相关多糖结构与功能关系的研究具有重要的指导意义。藻聚糖硫酸酯是一种分子量较高的水溶性杂多糖，具陆地植物成分所无法比拟的抗凝血、抗肿瘤、抗HIV、抗血栓、提高免疫力和降血脂等活性。李珊珊[3]对六种I型聚鼠李半乳糖醛酸（RG-I）和六种聚半乳糖醛酸（HG）果胶抑制流感病毒神经氨酸酶的活性进行了研究。利用实验室建立的生物发光法和经典的底物荧光法，研究果胶级分地抑制流感病毒H1N1和H5N1神经氨酸酶的活性。结果表明，富含HG结构域的果胶级分抑制活性明显高于RG-I级分。据各个级分的结构特征可以推测，HG结构域是具有抑制流感病毒神经氨酸酶活性的主要活性单元，而葡萄糖侧链的存在会大大促进这种抑制作用。RG-I果胶没有直接抑制流感病毒神经氨酸酶的活性。段科、单虎[4]等以自制的浒苔多糖为原料，采用微波辅助盐酸/过氧化氢降解浒苔多糖（EP）。通过软件计算，EP的IC50=1.059 mg/mL，而通过降解反应后，降解浒苔多糖（LEP）的IC50=0.348 mg/mL，可以明显地看出LEP对·OH的清除效果高于EP。魔芋多糖(konjac glucomannan,KGM)及其降解产物有体外抗肿瘤活性，其活性因分子量的大小不同而不同。涂立英[5]以KGM原料，采用gamma;-辐照处理和酶解法分别获得了不同分子量的KGM。魔芋低聚糖（KOS）及酶解产物100KGy-KGM能显著增强巨噬细胞吞噬的能力，显著提高细胞释放TNF-alpha;的能力，促进NO分泌和细胞增殖，而KGM对巨噬细胞免疫活性没有影响。
多糖片段的获得需要经过降解，目前研究较多的降解方法主要有三大类：化学法是较为常用的方法，一般包括NaNO2降解、酸降解以及氧化降解等，该类方法操作简单，经济适用；生物法是指利用专一性或非专一性水解酶降解多糖的方法，其特异性较高，易重复，但代价昂贵；物理法是近年来逐渐使用的方法，包括利用辐射、微波以及超声波等进行多糖降解[6]。上述多种方法中酸降解最为常用，其作用依据是酸性溶液能引起糖苷键的断裂，使多糖降解为低分子片段，通过控制酸的浓度、反应温度及时间等条件可获得不同分子量大小的降解产物[7]。
在早期研究人体对于细菌感染时的免疫机制时发现，细菌细胞壁会刺激机体产生明显的免疫响应[8]。细菌细胞壁的主要成分为beta;-葡聚糖、甘露聚糖以及壳聚糖[9]，这些物质便被认为是经典的免疫调节物质，可以在临床用药中达到免疫佐剂的作用。前期调研发现，已有多项临床数据说明酵母来源的可溶性beta;-葡聚糖与单抗联合应用时可以有效的抑制肿瘤生长速度、转移速度并延长患者的存活时间[10-11]。二者的联合用药激发了免疫系统中CR3依赖性细胞介导的细胞毒作用（CR3-DCC）。在抗体原有的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）以及补体依赖性细胞毒作用（CDC）的基础上，CR3-DCC的表达加强了肿瘤杀伤作用[12]。本课题拟从酿酒酵母菌的细胞壁中提取纯化获得纯度较高的beta;-葡聚糖（BG），通过化学降解的方式制备可溶性的beta;-葡聚糖寡聚片段，以建立不同结构信息的beta;-葡聚糖库来实现解释其构效关系的目的。
BG主链葡聚糖由beta;-(1→3)糖苷键连接，在其6号位上随机存在葡聚糖支链。相对于大分子量未降解的葡聚糖存在的难溶问题，降解之后的寡聚片段其主链、支链长度均有所变短，随着分子量的降低，其溶解性逐渐改善，因此对其展开片段化功能结构的研究一方面将有助于阐明beta;-葡聚糖免疫调节活性的结构基础，推动多糖结构与功能关系的研究，另一方面可增进对活性机制靶点的认识，促进更多同类多糖分子的发现以及作用靶点的相关研究。
- 研究目的和意义
本课题旨在在用温和条件下，如将离子交换树脂与凝胶层析树脂联合应用于葡聚糖样品的纯化工艺，以此来提高酵母葡聚糖的纯度，同时辅以有效的降解处理，降低样品的分子量，改善其溶解性。
通过降解处理获得比完整多糖有更强的活性的降解片段。相应片段分子量较低，结构信息获取较多糖母体容易，这对相关多糖结构与功能关系的研究具有重要的指导意义。
- 研究内容
1. 酵母beta;-葡聚糖的制备；
根据前期文献调研进行酵母beta;-葡聚糖的制备，其主要流程如下：通过YPD培养基对酿酒酵母菌进行发酵制备，接着对酵母进行诱导自溶、高温抽提等预处理后，采用珠磨机法进行破壁，所获得粗品经脱脂处理后利用离子交换层析以及凝胶层析等分离纯化手段，最终获得酵母葡聚糖BG精品。
- 均一化降解产物的制备；
采用化学降解的形式，对酵母葡聚糖进行降解模式的考察。实验中以还原糖的产生量判断降解终点，以此来掌握降解情况，同时以高效凝胶色谱所提供的分子量信息以及溶解性作为评价指标。
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