开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1研究背景：
肝素，又称未分级肝素(UnfractionatedHeparin,UFH)或普通肝素，在1916年在研究凝血的作用机制时偶然间在狗的肝脏组织中发现，并于1935年开始在临床上作为抗凝剂使用至今。它是一类具有天然抗凝血活性的酸性粘多糖，正因如此，它被定义为肝素。
肝素是一种硫酸化的多糖，属于糖胺聚糖家族，在哺乳动物的组织中分布很广泛,一些动物的组织如肝、肺、心、肾、脾、肠粘膜、胸腺、胎盘、肌肉以及血液中都可以看到肝素的身影。肝素是仅次于胰岛素的使用最广泛的天然药物,它通过与其他不同蛋白结合，可以发挥重要的生物活性，它可以激活抗凝血酶，加速抗凝血酶在凝血连锁中抑制丝氨酸蛋白酶的速率，从而被作为一种抗凝血的药物被广泛的应用；随着研究的进展，肝素的应用也越来越广，人们发现它不仅可以在抗凝、防栓形成和调节血脂浓度等方面发挥效用，而且在抗炎、抗过敏、抗病毒和抗癌等方面也有它特殊的生物学效用[1-2]。
当前肝素有很大的市场需求量，且这种需求还在不断扩大，同时它发挥的作用也变得更加显著。这么多年里，还没有出现一种可以完全替代肝素的产品，因此，它依旧是一种非常重要的抗凝血和抗血栓的生化药物。2010年我国肝素及其盐的出口呈现了强劲增长势头，但是我国生产的肝素产品仍然存在着一个问题，那就是我国生产的肝素在提取率和效价方面都比较低，且我国生产的肝素大多数都是以粗品肝素的形式低价出口到国外。因此，针对我国目前肝素生产存在的这些问题，开发出一种更加高效提取和分离纯化肝素的技术，具有十分重大的意义[3]。2008年上半年在美国发生的肝素钠污染事件导致一百多人死亡，这个事故让动物源性HP的质量成为广泛关注的焦点，同时也引发了对非动物来源HP的需求，采用安全有效的新方法合成肝素和硫酸乙酰肝素已成为需要首要解决的问题。所以我们采用生物工程的方法，以heparosan为前体合成HP提供了一种新的、更为安全且较有希望的非动物源性生产方式。
肝素前体(heparosan)，是某些病原菌荚膜中的糖胺聚糖成分，结构式为［-GlcUA-beta;(1，4)-GlcNAc-alpha;(1，4)-］n(其中GlcUA是葡萄糖醛酸;GlcNAc是乙酰氨基葡萄糖)，具有与肝素类似的多糖骨架，其未被硫酸化且未将葡萄糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸，可作为肝素、硫酸乙酰肝素的生物合成前体物[4]。
肝素前体一般可通过化学合成和生物合成。但由于化学合成过程复杂且成本高，市场竞争力大。利用微生物来源的heparosan合成抗凝血的肝素以及硫酸乙酰肝素成为目前研究的最新热点。利用大肠杆菌K5的天然菌株进行heparosan的提取制备，此方法虽然有无法比拟的经济优势，但由于此类菌株所固有的致病性所产生的安全隐患以及这种方法制备heparosan其单糖组成和糖链延伸也无法进行控制等弊端使得利用基因工程和代谢工程技术开发新型的重组微生物表达系统制备heparosan逐渐成为研究的热点。
肝素前体属于粘多糖，而多糖类物质家族中，糖链长度与其生物功能密切相关[5-6]，并且天然多糖类物质为混合物，其结构一般由多个重复的单元单位构成，最小重复单位由若干个相同或不同的分子通过不同的化学键连接而成[7]，糖链上重复单位聚合数分散情况的差异造成了其物理化学性质和生理生化作用的极大差别。均一多糖的制备和分子量调控一直以来是制约多糖这种重要的生物大分子研究、应用和药物开发的瓶颈之一。具体到肝素，这种生理活性和实际应用价值由分子量和均一度性质决定的糖氨聚糖类多糖分子，对其分子量进行调控并保证其良好的均一度显得更加重要。
2研究目的：
本课题旨在利用不具有肝素前体合成能力却可以可分泌表达外源多糖的基因工程菌株，即引入了肝素前体合成酶pgla和以及一系列肝素前体合成关键酶基因的枯草芽孢杆菌，进行发酵培养及条件优化，并根据糖氨聚糖的结构和带电特点，制定合适的分离纯化工艺，对产物初步鉴定同时测定分子量。
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