山羊乳汁中重组人血清白蛋白纯化工艺研究
一、 研究目的
建立从奶山羊乳汁中纯化重组人血清白蛋白（recombinant human serum albumin，rHSA）的技术系统，获得高纯度的药用人血白蛋白。
二、 研究背景
人血清白蛋白是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，其在血浆中有多种生理活性，例如：维持血浆渗透压，维持血液pH值的稳定，携带运输多种配基（例如脂肪酸，胆红素，金属离子等）等。白蛋白是目前产量最大，临床上用量最大的药用蛋白，可以用于治疗烧伤，水肿，低蛋白血症，及用于手术输血或危重病人补液等。
随着人们生活水平的提高，对血清白蛋白的需求量也在不断增加。传统白蛋白的生产方法主要是从人或动物血液中提取，这样的生产方式不仅受到血浆供应的限制，来源分散，并且血液中有可能携带肝炎病毒，艾滋病病毒等病毒传播的高风险性。基因工程技术可以很好的解决这一难题。国际上以rHSA替代血源产品的应用已成为趋势，国内市场需求也逐年扩大。其具有纯度更高、安全、高效、绿色环保、廉价、无限量供应等明显优势。迄今，已经有很多研究尝试利用各种酵母菌来大规模制备rHSA[1]。也有学者研究了用驼血清白蛋白代替人血清白蛋白[2]。还有学者利用转基因水稻种子大规模生产出了重组人血清白蛋白[3]。目前，利用酵母生产的rHSA已经步入产业化用于替代人血清白蛋白，转基因水稻中生产的rHSA现在还仅做为试剂在销售。尽管如此，rHSA的供给量尚无法满足全球每年对人血清白蛋白的需求，缺口很大[4]。
人血清白蛋白通常用作静脉直接灌注或注射剂，对纯品纯度要求较高。HSA临床用量大，每支剂量可达10g，产品中即使有害物质为0.001%，每针仍有0.1mg会被注射到人体内，有可能造成很大的危害。相比而言，大多数蛋白质药物如激素、细胞因子每支剂量仅为mu;g或ng级，因此，HSA类药物对纯度的要求更为严格[4]。1946年Cohn等人首先研究出大规模分级分离人血浆蛋白的方法：利用乙醇的低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度条件下在不同浓度乙醇中溶解度不同分离血浆蛋白质，可以生产出多种血浆医用蛋白，成为著名的Cohn乙醇沉淀法。1971年Newman等人对此方法进行了改进，将血浆在2-4℃ 进行沉淀分离，可在同一过程中得到更多产物如血液第八因子、血纤维蛋白原等，成为目前广泛使用的冷乙醇沉淀法。其他的纯化技术还有例如离心分离、热处理、酸处理、TCA沉淀法、丙酮沉淀法、辛酸钠沉淀法等。1977年Culing等人提出用色谱技术纯化白蛋白，但当时仅仅进行了实验室尝试。1983年Berglf等人应用色谱集成技术进行了HSA试验性生产，该方法有效地减少了蛋白质聚集及变性，纯度达99%[5][6]。发展到目前，建立简便，高效且易于放大易于自动控制的分离纯化方法也是降低成本，实现rHSA大规模生产的关键。rHSA 的初步纯化方法主要有两大类，一是采用离心或过滤实现固液分离作为分离纯化的第一步（Filter Press法），另一是利用层析分离原理直接将发酵液上柱处理（Streamline法），一般采用扩张床吸附技术，瑞典的Pharmacia Co.及日本的Yoshitomo Pharmaceutical Industries,Ltd在rHSA的提取过程中均采用了该技术。粗提后的rHSA纯度可达90%，必须经过进一步的纯化。rHSA精制过程主要采用了不同层析吸附法，包括疏水层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、金属螯和亲和层析、亲和染液层析，凝胶过滤等，还可根据需要选用超滤和透析[6]。
利用多级色谱法生产的HSA其纯度、产量、单体含量均高于冷乙醇沉淀法，而且生产条件温和，生产周期较短，可以进行封闭式生产，并能实现流程自动化。
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