昆虫海藻糖酶及其抑制剂研究进展
摘要：海藻糖被称为昆虫“血糖”，源于该糖为昆虫血淋巴中的主要糖类物质，在昆虫生长、发育、蜕皮等正常生理活动中有着重要的作用。昆虫的海藻糖在能量需求时通过海藻糖酶（trehalase，TRE）降解为葡萄糖，用于能量供给。海藻糖酶在昆虫体内可分为膜结合型海藻糖酶和可溶性海藻糖酶。井冈霉素（validamycin，VAA）与海藻糖的构造非常相似，但和海藻糖酶的亲和力更强，因此VAA可通过与海藻糖“争夺”海藻糖酶来实现对海藻糖酶的抑制作用。本文综述前人在海藻糖代谢、海藻糖酶抑制剂方面的最新研究成果，为将来开发和利用井冈霉素绿色农药防治害虫提供理论依据。
关键词：井冈霉素；海藻糖酶；海藻糖代谢；几丁质
海藻糖为一种非还原性糖，广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物中，海藻糖不仅是昆虫血淋巴中的重要糖类和能量物质，而且在昆虫的生长、发育、蜕皮变态等一系列生命活动活动中具有重要作用，因此被称为昆虫的“血糖”（ELBEIN AD et al., 2003；唐斌等，2012；TANG B et al., 2014）。昆虫通过海藻糖酶来降解海藻糖，为其进行的一系列生命活动提供能源。海藻糖不仅是能量来源物质，而且是一种重要的抗逆物质，在各种环境压力条件下保护机体免受损伤（IORDACHESCU M et al., 2008; TANG B et al., 2008; SHUKLA E et al., 2015; LIU JH et al., 2016）。海藻糖酶是昆虫几丁质合成通路的第一个酶，研究表明海藻糖的合成和降解都能通过控制几丁质合成通路从而影响昆虫发育（CHEN J et al., 2010; ZHAO LN et al., 2016; YANG MM et al., 2017）。考虑到包括人类在内的高等哺乳动物不能自身合成海藻糖（ARGuuml;ELLES JC, 2014），海藻糖酶水解海藻糖到两个葡萄糖单位，这个过程是昆虫必不可少的生命功能，但这一过程并不影响脊椎动物（Matassini C et al., 2020），海藻糖代谢途径具有作为相对安全的控制靶标的潜力。井冈霉素的活性机制依赖于它独特的化学结构。首先井冈霉素的糖基帮助井冈霉素进入目标生物,而有效氧胺A基团进入细胞后,干扰目标生物的代谢,从而表现出各种活性（徐利剑等，2015）。研究发现井冈霉素的活性机制可以表现为3个方面：(1)具有抑制真菌和昆虫的海藻糖酶活性,使海藻糖不能分解成葡萄糖；(2)抑制肌醇的生物合成来影响磷脂的产生；(3)抑制致病真菌的纤维素降解酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性，从而降低致病力（张穗等，2001；Ishikawa R et al., 2005）。其中抑制海藻糖酶的活性被认为是井冈霉素最主要的生物活性机制。井冈霉素从20世纪70年代开始用来防治水稻纹枯病与小麦纹枯病,一直沿用至今。然而，井冈霉素能否调控昆虫海藻糖代谢？井冈霉素能否通过抑制昆虫海藻糖酶活性，实现对害虫的防治？能否将井冈霉素开发成为高效的生物农药？通过对井冈霉素的化学结构进行研究，昆虫海藻糖代谢相关基因的功能研究，越来越多的研究结果表明井冈霉素会打破昆虫体内的海藻糖代谢平衡（范柯琴等，2009；申屠旭萍等，2005），导致海藻糖酶活性降低，昆虫几丁质合成受阻，通路相关基因的表达降低、几丁质含量显著下降并产生高死亡率（CHEN J et al., 2010; TANG B et al., 2010; TANG B et al., 2016; CHEN J et al., 2010），这表明利用井冈霉素对海藻糖酶的抑制效果适合作为研发生物农药的着力点（KERN C et al., 2012; TANG B et al., 2017）。
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海藻糖酶及海藻糖代谢
- 海藻糖酶
海藻糖水解酶又称海藻糖酶（trehalase，TRE或Treh），最初由Bourquelot于1893年在黑曲霉（Aspergillus niger）中发现，之后发现其广泛存在于真菌、植物、昆虫和其他无脊椎动物及脊椎动物中（王军娥和刘净，2009）。在昆虫体内，海藻糖酶可将昆虫的“血糖”——海藻糖水解为葡萄糖，海藻糖酶通过活性点位与海藻糖的羟基通过氢键进行结合，海藻糖环上的氧形成氧碳翁离子与酶上的羧基通过静电作用络合，桥头键在水分子作用下断裂的过程，进行海藻糖水解。葡萄糖参与昆虫体内糖酵解过程与三羧酸循环，最后氧化为二氧化碳和水（朱本全和杜馨，2019）。
在昆虫的飞行活动中，昆虫利用海藻糖酶（Trehalase，简称 TRE）通过控制海藻糖的水解为昆虫活动提供能量，海藻糖酶的活性变化影响昆虫的能量代谢，飞行与繁殖等生命活动（Shukla E et al., 2015; 秦加敏等，2015）。昆虫体内含有两种海藻糖酶：可溶性海藻糖酶（Soluble trehalase，简称 TRE1）和膜结合型海藻糖酶（Membrane-bound trehalase，简称TRE2）（Terra WR et al., 1994; Dong CN et al., 2021）。可溶性海藻糖酶游离在细胞质中，主要存在于昆虫消化道和血淋巴中；膜结合型海藻糖酶结合在肌肉的线粒体膜上，在昆虫卵巢，脑组织和需要消耗大量能量的飞行肌肉等组织中可以找到（杨艳等，2005；王军娥和刘静，2009）。可溶性海藻糖酶游离在细胞质中，主要存在于昆虫消化道和血淋巴中；膜结合型海藻糖酶结合在肌肉的线粒体膜上，在昆虫卵巢，脑组织和需要消耗大量能量的飞行肌肉等组织中可以找到（杨艳等，2005；王军娥和刘静，2009）。两种海藻糖酶在不同组织中对昆虫的能量代谢的流动进行调节，并相互协作，维持昆虫体内能量量供应。目前认为可溶性海藻糖酶与膜结合型海藻糖酶在大部分昆虫中可同时存在，且由不同的海藻糖基因编码，但两种海藻糖酶来源于同一遗传子（Oliver et al., 1978; Zh S et al., 1993; ZH et al., 1994）。昆虫体内海藻糖代谢与几丁质代谢密切相关，几丁质是昆虫外骨骼和围食膜的主要成分，它的合成、转化和修饰与昆虫的生长发育联系紧密（Zhu KY et al., 2016）。昆虫幼虫每生长到一定的阶段都需要蜕掉旧表皮，形成新表皮，这个过程由几丁质合成通路及几丁质降解途径共同完成（闫晓平等，2017）。TRE是几丁质合成通路中的第一个酶，TRE催化海藻糖水解成葡萄糖，葡萄糖接着通过剩余7个酶的催化最终形成几丁质，TRE在几丁质合成中的重要性不言而喻。近年来，通过对赤拟谷盗、甜菜夜蛾、褐飞虱、马铃薯甲虫等多种昆虫的海藻糖酶-几丁质调控通路的研究，结果均表明TRE对几丁质的合成与分解存在一定的调控作用（魏苹，2013）。可溶性TRE1和膜结合型TRE2的功能还存在一些差别，TRE1与TRE2调控不同部位的几丁质合成。昆虫海藻糖合成的潜在途径及与几丁质合成代谢的关联如图1所示。
TRE：海藻糖酶Trehalase；HK：己糖激酶Hexokinase；CHS：几丁质合成酶Chitin synthase；Cht：几丁质酶Chitinase；Hex：beta;-N-乙酰乙糖胺酶beta;-N-acetylhexosamindase or beta;-N-acetyl-D-hexosamindase；TPS：海藻糖合成酶Trehalose-6-phosphate synthase；TPP：海藻糖-6-磷酸酯酶Trehalose-6-phophate phosphatase
图1 昆虫海藻糖供给与几丁质代谢路径（TANG B et al., 2018）
两种海藻糖酶在不同组织中对昆虫的能量代谢的流动进行调节，并相互协作，维持昆虫体内能量供应（Elbein AD. 1974）。1992年，从黄粉虫（Tenebrio molitor）中提取和分离出昆虫首个TRE1，它是一种胞质酶，游离于细胞质之中，负责内源性海藻糖的分解，主要存在于循环系统和消化系统中，如血淋巴、中肠和马氏管中（TAKIGUCHI M et al., 1992）。膜结合型海藻糖酶被发现和克隆则比较晚，直至2005年才从家蚕（Bombyx mori）中克隆得到（MITSUMASU K et al., 2005）。研究发现TRE2为胞外酶，主要存在于微绒毛或基侧膜上，与肌肉中的线粒体结合，负责外源性海藻糖的吸收和同化，在脂肪体、中肠和马氏管中高表达（MITSUMASU K et al., 2005; BECKER A et al., 1996; Muuml;LLER J et al., 2001; SILVA MC et al., 2004; DEALMEIDA FM et al., 2009, 马龙，2014）。近年来借助基因组测序技术，采用高通量测序技术进行转录组等研究发现昆虫TRE1不止一条编码基因存在，如褐飞虱包含TRE1-1和TRE1-2两条（ZHAO LN et al., 2016; 赵丽娜，2014），赤拟谷盗有TRE1-1、TRE1-2、TRE1-3和TRE1-4 4条可溶性海藻糖酶基因（TANG B et al., 2017; 魏苹，2013），异色瓢虫（Harmonia axyridis）中存在3条或3条以上的TRE1（TANG B et al., 2015; SHI ZK et al., 2016），其中TRE1已在多种昆虫中被克隆（SHI ZK et al., 2016; PARKINSON NM et al., 2003; LEE JH et al., 2007; TATUN N et al., 2008; 张倩等，2012）。这些研究结果表明在不同昆虫体内，海藻糖酶基因具有种类多样性的特点。
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