考马斯亮蓝法测定血浆中的蛋白质含量
一、课题研究的背景与目的
蛋白质作为生命活动的基础物质，是构成一切细胞和组织的重要组成成分，具有许多生物学功能。蛋白质也是生物体细胞中含量最丰富的高分子有机化合物，其分离、提纯、定性、定量分析是食品、药学和生命科学研究中经常涉及的重要内容,也是生物化学和其他生物学科、食品检验、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。目前，蛋白质含量测定的方法有凯式定氮法，双缩尿法试剂、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外分光光度法和考马斯亮蓝法（Bradford法）等。其中凯氏定氮法是测定粗蛋白质的经典方法,但由于样品中非蛋白质含氮化合物的干扰,使得测定结果不能完全反映被测样品中真实蛋白质的含量；双缩脲法，灵敏度低，样品用量大，不能用于一些微量蛋白含量的测定；Folin－酚试剂法是测定蛋白质浓度应用最广泛的一种方法，它由于受蛋白质氨基酸组成的影响，及酚类等一些物质的存在，导致分析误差；紫外分光光度法，简便、快速、不损失样品，但若样品中含有其他具有紫外吸收的杂质，如核算等，会产生较大误差。
考马斯亮蓝法，是一种迅速、可靠的通过染料法测定溶液中蛋白质的方法。其原理是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同的颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000mu;g/mL，最小可测2.5mu;g/mL蛋白质。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
人体血浆、血清、脑脊液等体液中含有种类众多的蛋白质,能够提供大量关于机体健康状况或疾病状态的信息,从中可寻找诊断疾病的特异性标志物、提示疾病阶段或评价疗效的指标,或探寻新的临床药物作用的靶蛋白。但这些标志物或靶蛋白在血浆和血清中的含量大多很低,易被更高含量的蛋白质的信息所掩盖,给研究带来困难。因此在进行蛋白组学研究中,有必要对血清样本进行特殊的预处理,先去除血清中的高分子量、高丰度的蛋白,排除它们对低丰度蛋白质的掩盖作用,促进低丰度蛋白质的检出。目前常用的技术有蛋白质沉淀法、亲和技术、色谱技术等。
蛋白质沉淀法是一种快速的杂质蛋白质去除方法,常用的蛋白质沉淀剂有乙腈、甲醇、乙醇等。本课题主要应用考马斯亮蓝测定蛋白质含量的方法对乙腈、甲醇等有机溶剂沉淀法对去除血清中高丰度蛋白和富集小分子蛋白的效果进行探索研究。
一、主要研究内容
本课题拟采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量的方式对乙腈、甲醇、乙腈（含0.1%甲酸）、甲醇（含0.1%甲酸）四类有机溶剂沉淀血浆蛋白的分析方法进行验证。
二、主要研究方案
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