开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
肺动脉高压(PAH)是一种肺血管血液动力学异常的炎症型疾病，表现为肺血管平滑肌细胞(smooth-muscle cells, SMCs)过快增殖导致的肺血管堵塞、血管肌化、高度炎症化等。PAH会导致破坏性的心肺功能障碍，血管重塑导致肺动脉压力升高和右心室肥厚(RVH)。逆转不利的血管重塑及清除或者减缓肺血管平滑肌细胞的过快增殖是PAH治疗中的两个重要方向。
黄芩素是一种天然黄酮类化合物，已被证明具有抗增殖、抗炎、抗氧化和心脏保护作用。黄芩素通过抑制血管重构减轻野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压，部分机制是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和神经纤维素受体b(nf-b)途径抑制肺动脉重构对肺动脉高压进行改善1。另有研究发现2黄芩素可以直接调节内源性和外源性凋亡通路的成分。Bcl-2家族由一组结构相关的蛋白组成，在内源性凋亡途径中起重要作用。Bcl-2家族蛋白既可以是促凋亡蛋白(如Bax、Bad、Bak)，也可以是抗凋亡蛋白(如 Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和Bcl-w)。凋亡基因 Bcl-2家族蛋白的比例决定了细胞的命运。在人舌癌 SCC-4细胞中，黄芩素通过提高促凋亡剂(Bax)水平和降低抗凋亡蛋白 Bcl-2水平成功诱导细胞凋亡3。不过，与其他黄酮类化合物一样，黄芩素在人体和大鼠的肠道和肝脏中存在严重的首过代谢，导致其生物利用度低，主要表现为葡萄糖醛酸化、硫酸化和甲基化。由于口服生物利用度低，游离BAI的临床应用受到限制4。近年来，在提高非创性药物的口服生物利用度方面做了一些工作。建立了BAI的自微乳给药系统(SMEDDS)，体内实验结果显示，与BAI混悬剂相比，其相对生物利用度提高了约200.7%5。采用乙醚注射法制备含有黄芩素(BAI)的长循环纳米脂质体(LCNs)，以大豆磷脂酰胆碱(SPC)和胆固醇(CHOL)为载体材料，包封率(EE)为41.5plusmn;4.77%。BAI-LCNs的血浆浓度可在3h后达到峰值，并可在6h 内维持，与BAI溶液相比，BAI-LCNs的口服生物利用度提高了4.52倍 6。
p53基因为人体抑癌基因，p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。其野生型使癌细胞凋亡，从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。p53的突变型会提高癌变。这几年已有研究发现，p53对PAH也有影响。自缺氧诱导的PH小鼠(mice)和野百合碱(MCT)诱导的PH大鼠(rat)，与正常对照组相比，野百合碱介导的PH (MCT-PH)大鼠离体肺动脉(PA)[主要由PA平滑肌细胞(PASMCs)组成] p53含量降低，并且与bax/bcl-2比值降低有关。MCT-PH大鼠分离的PA中p53的减少，与促凋亡蛋白Bax的减少和抗凋亡蛋白Bcl-2的增加有关，而全肺组织(主要含有ECs)p53含量升高与bax/bcl-2比值升高有关。PASMCs中促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值降低，可抑制细胞凋亡，促进缺氧诱导的细胞增殖和PA内侧肥大。此外，增加的bax/bcl-2比例可增加PAECs细胞凋亡，引起内皮功能障碍或损伤。p53的过度表达下调了肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖和迁移7。
然而，非病毒载体的基因表达通常是短暂的，只持续几天。因此，需要重复注射表达载体以维持目标组织中的治疗性蛋白质浓度。所以人们考虑制备含质粒DNA的纳米粒子提高pDNA在体内的停留时间。研究发现，使用生物相容性聚合物聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）配制的可生物降解的纳米颗粒（直径约200 nm）具有持续传递基因的潜力。转染wt-p53 DNA纳米粒的细胞比裸wt-p53 DNA或wt-p53 DNA与市售转染剂(Lipofectamine)复合的细胞表现出持续且显著的抗增殖作用。与裸wt-p53 DNA或wt-p53 DNA-lipofectamine复合物转染的细胞相比，转染wt-p53 DNA纳米颗粒的细胞表现出持续的p53 mRNA水平，从而解释了纳米颗粒的持续抗增殖活性。裸DNA转染的细胞表现出短暂的细胞内DNA滞留。因此纳米粒子介导的wt-p53基因转染具有持续的抗增殖活性，可能在肿瘤治疗中发挥重要作用8。于是我们猜想纳米粒子介导的p53对PAH的作用也会增强。
然而，由于纳米载体生物相容性差、载药量低、制备工艺复杂，其临床应用受到很大限制。而且细胞内蛋白质传递仍然是一个挑战。蛋白质进入细胞质是获得细胞内靶向性的前提。不幸的是，这些纳米载体通常通过内吞途径进入细胞，并被内切酶/溶酶体包裹，从而导致药物，尤其是基因药物的降解，从而影响其治疗效果。因此，从内切体-溶酶体系统逃逸是细胞内蛋白质运输的关键步骤。
团队之前对此有过研究，为了共载DTX和miRNA-34a，将DTX封装在纳米载体的脂质核中，miRNA-34a通过静电作用与CBSA自组装在纳米载体的外壳中，纳米载体能够成功地负载DTX和miRNA-34a，并且具有足够的稳定性。重要的是，纳米载体通过小窝介导的途径进入细胞溶胶，而不会被内质体/溶酶体包裹，从而提高了载体的利用率。共递纳米载体在体外抑制了抗凋亡基因Bcl-2在转录水平和蛋白水平的表达，抑制肿瘤细胞迁移，有效地诱导细胞凋亡和细胞毒性。在体内延长了DTX的血液循环，增加了肿瘤物质的积累，并对4t1荷瘤小鼠肿瘤的生长和转移有明显的抑制作用。
另有研究团队将蛋白质包覆在PTX不溶性纳米药物颗粒上，制备了稳定的PTX纳米混悬剂(PTX-ns)，克服了由于成核和颗粒长大而导致的纳米悬浮剂不稳定。通过beta;-lg蛋白质的疏水区和药物颗粒的疏水表面之间的相互作用对PTX-NS产生显著的稳定作用，导致蛋白质的构象改变、二级和三级结构的丢失以及Trp残基向疏水状态的转变。同样，PTX-NS可以以能量无关的方式直接穿过细胞膜进入细胞溶胶，而不会在内涵体-溶酶体系统中被困住 9。
受之前这些研究启发，我们尝试用荷电蛋白包裹黄芩素制备纳米颗粒，黄芩素与蛋白之间通过疏水相互作用提高稳定性。p53带负电，所以通过静电作用将p53与纳米颗粒相连接，制备成黄芩素-p53纳米复合物，并通过一系列纳米表征技术对制备的纳米颗粒进行评估。实验需要用到自缺氧诱导的PH小鼠(mice)和野百合碱(MCT)诱导的PH大鼠(rat)进行体内实验，HIF因子作为指标之一。同时需培养PASMCs细胞和PAECs细胞进行体外实验。
参考文献：
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