基于金纳米粒给药系统的近红外光介导同步光热与光动力治疗基础研究文献综述

一、研究或设计的目的和意义：

目前医学上治疗肿瘤的方法主要为手术、化疗、放疗等，但由于此类方法对DNA及正常组织具有很强杀伤力，从而无法保证患者的生存质量。针对目前光热治疗中由于肿瘤内部不均匀热量分布导致的不能完全杀灭所有肿瘤细胞的现状，以及光动力治疗中由于光敏分子在近红外区域吸收弱，导致的近红外光敏反应激发效果差、光毒性低的问题，将光敏分子血卟啉单甲醚装载在具有强近红外光热转化效率的中空金纳米粒上，用具有对肿瘤EphB4特异性结合能力的新型TNYL多肽修饰表面，构建一种静脉注射用新型多功能纳米载体双光敏金纳米粒，实现近红外光激发的同步肿瘤靶向光热与光动力治疗。

二、研究或设计的国内外现状和发展趋势：

研究表明，由光敏剂血卟啉单甲醚介导的光热疗法对于恶心增生疾病具有良好的治疗效果，具有低毒、高效、靶向性强的特点，因而近年来受到密切关注。但是，由于光敏剂在光照下不稳定，易发生光解，且产生的单线态氧对于正常细胞也具有很强的杀伤力，使得其临床应用受到极大限制。当光敏剂分子与金纳米粒结合后，由于金纳米能够吸收光敏剂经光照后产生的能量，使光敏剂发生荧光猝灭，将光能转变为热能，由此可大幅降低光敏剂的细胞毒性，并且其在光照下产生的高热对癌症细胞具有良好的杀伤力，可显著提高药物的靶向性及治疗效果。

因此，光热及光动力的结合不仅能够提高药物制剂的稳定性，并且具有更高的肿瘤靶向性以及更好的抗肿瘤效果，对肿瘤的治疗具有广阔的发展前景。

三、拟研究解决的问题和思路：

（1）光敏剂的稳定性及细胞毒性研究

（2）对中空金纳米粒合成方法进行详细的方法学研究

（3）建立有关物质与中空金纳米粒的合成途径

（4）通过建立的方法实现对HMME的装载并合成HMME-HAuNs

四、研究技术方案

本课题将首先合成中空金纳米，后采用中空金纳米壳对血卟啉单甲醚的作用进行补充，通过MTT细胞毒性试验以及单线态氧产生量的测定对其细胞杀伤力进行评价，最后探索中空金纳米对光敏剂血卟啉单甲醚的装载方法。

五、研究方法

（1） 中空金纳米粒的合成及表征

包括：粒径及电位、紫外吸收、光谱透射电镜及扫描电镜观察

1) 在除去氧气的柠檬酸钠缓冲溶液中加入氯化钴和硼氢化钠溶液，形成钴纳米粒，采用光动力散射法测定粒子的大小和分布。

2) 将含有钴纳米粒的溶液与含有氯金酸的溶液混合，不断搅拌，使得金离子迅速被还原成金而沉淀于钴粒子的表面形成金壳。

3) 在反应体系中通入氧气后，核心的钴逐渐被空气中的氧气氧化形成钴离子而扩散出去，形成中空金纳米粒(HAuNs)。

4) 合成过程中，不同氯金酸的用量，可以获得不同金壳厚度的纳米粒，从而得到不同吸收波长的金纳米壳。控制一定钴粒子大小及氯金酸用量，可将HAuNs的等离子共振吸收峰调至近红外区域（700-900 nm）。采用分光光度法，在800nm处测可测定合成产物中空金纳米粒的量，用透射电镜可观察中空金纳米的大小形态。

（2）光动力疗法细胞毒性实验（MTT比色法）

1) 取状态较好的SKOV₃卵巢癌细胞，倒去培养液，用PBS洗，加入胰酶消化，加入含血清的1640培养液，吹打使细胞单个分散，在光学显微镜下计数稀释后接种于培养板。每接种一个孔需摇晃培养瓶，防止细胞下沉导致的种板不均匀。

2) 24 h后，将培养板从孵箱中取出，显微镜下观察，吸去原培养液，加入100L含有如下试剂（见下表）的培养液（注意加药前先超声溶解分散）。

3）将培养板放入孵箱中继续培养6h，使得其充分摄取药物。

4）实验组分别进行激光照射（1.5W/2min）,控制组除外。然后在37℃下分别孵育48 h，后每孔加入20L 5mg/ml的MTT溶液（临用前30min配制，5mg/mL），继续孵育4 h。

5）加入100L DMSO用以溶解结晶紫。

6）将培养板水平振荡20 min，充分溶解结晶紫，随后用酶联检测仪在570 nm处测定吸光值A，按下式计算细胞抑制率。

细胞抑制率(%)= ( 1 -A_T/A_C )100%

A_T为实验组570 nm处的吸光值

A_C为空白对照组570 nm处的吸光值

7）以载体或药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作细胞抑制率曲线。

（3）光敏剂HMME单线态氧产生的测定

光敏剂血卟啉单甲醚具有独特的光学活性，其在特定波长的光辐照下，能和氧分子发生生化反应，产生对细胞具有毒性作用的单线态氧等活性氧(reactive oxygen species，ROS)，从而达到细胞杀伤作用。DPA是常用的化学捕获剂，其与单线态氧可以快速发生氧化还原反应生成稳定的内氧化物，导致其原有的苯环结构遭到破坏，使得起紫外吸光度发生变化。该反应的反应常数为1．310 L／(molS)，通过用紫外分光光度计测定DPA在355 nm处的吸光度减少量即可以测量单线态氧的含量。

（4）HAuNs 对HMME的装载

在证明了中空金纳米和光敏剂血卟啉单甲醚的同步治疗作用后，可考虑将其进行化学连接，使得中空金纳米粒成为光敏剂的靶向载体材料，有望进一步提高光敏剂的肿瘤细胞靶向性以及癌细胞杀伤力。该连接过程的化学基础为：中空金纳米粒表面所带负电荷可以与PEI等带正电的高聚物进行有效的化学结合，与高聚物的连接能够保证高度的载药效率，PEI所带有的大量氨基可与血卟啉单甲醚发生脱水反应，可作为中空金纳米粒与光敏剂的连接物，从而对其进行化学装载。

①PEI-TA的合成

②HMME-HAuNS的合成

六、论文拟撰写的主要内容

（1）HAuNs合成

（2）光动力疗法细胞毒性实验（MTT比色法）

（3）光敏剂HMME单线态氧产生的测定

（4）HAuNs 对HMME的装载

（5）HMME-HAuNs的合成

七、进度安排

2014年2月24日3月21日 确定课题、完成论文开题报告

2014年3月22日4月8日 中空金纳米的合成、细胞毒性实验

2014年4月9日4月20日 光敏剂单线态氧产生量的测定

2014年4月21日5月10日 探索中空金纳米对光敏剂血卟啉单甲醚的装载方法

2014年5月11日5月17日 完成论文初稿

2014年5月18日5月24日 完成论文修改

2014年5月25日5月29日 论文定稿

八、参考文献

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