1.研究背景糖尿病通常伴随着大血管及微血管病变，而动脉粥样硬化（AS），表现为动脉粥样病变及血栓形成，是造成糖尿病患者死亡的主要原因之一。正常的内皮细胞可调节血管紧张度，维持血管结构，并可分泌抗凝、抗血小板物质和纤溶蛋白，同时具有抗炎作用，可防止中性粒细胞单核细胞等炎症细胞向血管壁黏附聚集。但由于损伤因素造成血管内皮功能障碍时，会出现血管张力调节障碍和黏附分子的表达异常等[1,2]。在实验条件下，暴露于高糖环境会诱发急性血管内皮功能障碍[3]，使得内源一氧化氮（NO）分泌异常及活性降低，其导致的血管痉挛、异常收缩及血管增生在AS的发生、发展过程中发挥着极为重要的作用[4,5]。黏附分子的表达异常可导致内皮细胞表面的异常高黏附性，黏附于内皮的单核细胞迁移至动脉内皮下间隙，分化摄取脂质转化为泡沫细胞，促进AS的发生和发展[6]。已经研究证实糖尿病患者血浆和组织中终末糖基化产物（AGE）蓄积水平明显增高[7]。AGE修饰蛋白有许多生物学活性作用。体外实验表明，AGE修饰蛋白可增加血管内皮细胞单层的通透性[8]，AGE修饰蛋白对单核细胞具有趋化作用[9]，AGE致内皮损伤[10]。在动脉粥样硬化形成早期，内皮细胞单核细胞相互作用及单核细胞浸润起着关键作用[11]，动脉粥样硬化斑块中，细胞间粘附分子（ICAM-1）及血管细胞粘附分子（VCAM-1）的表达增加，而TP受体可能通过提高ICAM-1及VCAM-1的表达参与动脉粥样硬化形成[12]，在细胞中二者基因表达可被TP受体激动剂提高。TP受体拮抗剂体外可改善内皮功能障碍，但是目前仍然没有针对此途径的有效的药物应用于临床。因此，研究具有降糖及内皮功能保护双重活性的药物将大大改善糖尿病患者的状况，并降低糖尿病心血管并发症的发生率。已有研究表明磺酰脲类降糖制剂具有内皮保护作用。如格列齐特是第二代磺酰脲内化合物，其能够通过抑制蛋白激酶C（PKC）途径降低高糖诱发的ICAM-1过表达[13]。而第三代磺酰脲类降糖制剂格列美脲，能够通过PI3-Kinase-Akt依赖途径调节人冠状动脉内皮细胞的NO生成量，起到内皮保护作用[14]。新型磺酰脲类化合物G004(1-{4-[2-(4-溴苯磺酰胺基)乙基]苯磺酰}-3-(反-4-甲基环己基)脲)是运用拼合原理,以具有降糖活性的磺酰脲结构为母核连接抗血小板聚集活性的化学基团设计而成,其体外促进离体胰岛细胞释放胰岛素、体内降低正常小鼠、大鼠、兔等动物的血糖作用已得到证实[15]。同时已有研究表明化合物G004体外试验可以抗ADP，花生四烯酸诱导的血小板聚集，体内有抗血栓作用[16]，因而极有可能具有血管内皮保护作用，能延缓或改善糖尿病并发的动脉粥样硬化形成。2.研究目的
本研究通过体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为模型，通过高浓度葡萄糖诱导HUVECs的损伤，观察G004对内皮细胞游离Ca2 、花生四烯酸（AA）代谢产物-血栓素B2（TXB2）及内皮NO分泌和一氧化碳合酶（NOS）活性的影响。同时，检测AGE修饰蛋白对血管内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1蛋白和相关基因表达的影响，阐述G004改善损伤血管内皮可能的分子机制。
3.课题内容计划及实施3.1.G004对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）相关物质释放的影响3.1.1游离Ca2 测定按细胞浓度1.0106ml-1将HUVEC接种于96孔培养板,每孔0.1ml。参照文献将Fluo3/AM负载细胞孵育45min[17]，于激发波长505nm发射波长530nm测静息期和加入药物后的荧光值F，加2%TritonX-100测得Fmax，再加EGTA测Fmin,通过下式计算钙浓度：[Ca2 ]=Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]，Kd=0.4mu;molL-1。实验分为四组：溶剂对照组组、模型组（KCl终浓度为75mmol/L）、药物组（加入G004不同浓度孵育0.5h后，再加KCl孵育0.5h）、硝苯地平组、格列美脲对照组。
3.1.2花生四烯酸（AA）代谢物测定参照文献[18]HUVEC细胞经扩增后，用0.25%胰酶消化制成细胞悬液，按细胞浓度0.3105ml-1接种于24孔培养板，每孔1ml。细胞在37℃、95%O2和5%CO2孵箱中孵育12h，贴壁后吸弃培养液，用PBS洗2次，加溶媒或含药的无血清DMEM继续培养4h，取上清液200mu;l，应用放免法测定6-keto-PGF1alpha;和TXB2。试验分组：溶剂对照组（仅加入适量溶媒）；试验组（加入不同浓度和G004，分别为100、10、1和0.1mu;molL-1，同一浓度平行4孔）和BM-531、格列美脲（浓度设置同G004）对照组，总体积为1ml.
3.1.3G004对内皮细胞NO合成量、NO酶活力的研究利用高糖造HUVEC损伤模型，细胞接种于96孔培养板，分组为正常对照组（5.5mmolL-1葡萄糖）、高糖对照组（30mmolL-1葡萄糖）、甘露醇对照组（25mmolL-1甘露醇 5.5mmolL-1葡萄糖）、G004与格列美脲组（按受试药物浓度分别为10,1,0.1mu;molL-1三个小组）、阳性药阿司匹林组（100mu;molL-1）。取各组培养液按试剂盒操作用常规规比色法测定细胞上清液中NO含量和NOS酶活力。NO计算公式为NO(mu;molL-1)=(样品管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)标准品浓度(100Lmol.L-1)样品测试前稀释倍数NOS活力计算公式为NOS（Umg-1)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/呈色物纳摩尔消光系数(反应液总体积/取样量)1/(比色光径反应时间)
3.2AGE对血管内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响3.2.1免疫细胞化学及免疫荧光分析终末糖基化产物（AGEs）是非酶糖基化和氧化作用修饰后的蛋白、脂质及多核苷酸。研究表明，AGEs在糖尿病视网膜病病及动脉粥样硬化形成中起着重要作用。ERK1/2andNF-kappa;B参与前炎症因子的活化过程[19]，是AGEs参与的损伤过程中的关键因子。AGEs制备将BSA与50mMd-glucos于无菌状态下放置12周(5%CO2/95%，37C)，使用磷酸盐缓冲液透析法除去多余的葡萄糖。使用激发波长370nm，发射波长460nm检测其荧光强度，-20℃保存备用。HUVEC细胞经扩增后，用0.25%胰酶消化制成细胞悬液，按细胞浓度1106ml-1接种于24孔培养板，向HUVEC细胞加入胶原（200ug/ml）、AGEs（200ug/ml）、G004 AGEs，ASA AGEs,溶剂 AGEs孵育48h后，使用冰浴PBS冲洗细胞，于4℃使用4%多聚甲醛固定后，加入0.5%冰浴tritonX100通透细胞，再于室温下加入5%胶原终止反应。向细胞中加入一抗p-ERK1/2(1:50),p-NF-kappa;Bp65(1:50),于荧光显微镜下观察HUVEC中由AGEs诱导的ERK1/2andNF-kappa;B的活化情况。3.2.2终末糖基化产物受体（RAGE）、粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达测定
HUVEC细胞经扩增后，用0.25%胰酶消化制成细胞悬液，按细胞浓度0.3105ml-1接种于24孔培养板，每孔1ml，向HUVEC细胞加入G004，ASA，溶剂孵育2h后，加入u-46619，8-iso-PGF-2alpha;，TNF-alpha;（TNF-alpha;作为阳性对照组）再孵育2h诱导ICAM-1及VCAM-1的表达。使用台盼蓝染色对细胞形态进行分析确定细胞存活率。
使用高纯度RNA试剂盒分离血管内皮细胞（HUVEC）中的总RNA，取1ug总RNA，使用cDNA合成试剂盒合成cDNA。再取50ul反应溶液进行DNA扩增。VCAM-1特异性引物序列为：上游引物5-CATCCACAAAGCTGCAAGAA-3，下游引物5-GCCACCACTCATCTCGATTT-3。ICAM-1特异性引物序列为:上游引物5-GCTGCGCCAGGCTCTCACCTTC-3，下游引物5-GGCTGCAGCCCTTTGCTCTCAA-3。RAGEmRNA的扩增：上游引物：5-CACCTTCTCCTGTAGCTTCA-3，下游引物：5-TGCCACAAGATGACCCCAAT-3。
4.统计分析方法
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