基于寡聚体的AD检测近红外荧光探针研究文献综述

一、 研究背景

阿尔茨海默症( Alzheimersdisease , AD)，又叫老年性痴呆，是一种慢性神经退行性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能；AD的主要病理特征是 beta;-淀粉样蛋白（beta;-amyloid,Abeta;）在细胞外沉积成老年斑以及由磷酸化 tau蛋白在细胞内形成的神经纤维缠结、神经元丢失和脑中tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结^[1]。AD的临床潜伏期很长(约10～20年)，目前药物只能改善AD患者的症状，尚无有效的药物能产生阻断或治疗作用^[2]。究其原因可能有两点:一是介入的时间过晚，此时老年斑已经形成，毒性形式的Abeta;已造成神经损伤；二是Abeta;形成纤丝前的可溶性寡聚体为更具毒性的Abeta;形式，目前还缺乏高效特异性Abeta;寡聚体抑制剂。另一方面，有效抑制Abeta;寡聚体的形成和毒性作用是AD治疗的重要途径之一^[3]。因此，针对Abeta;寡聚体的早期诊断对AD的治疗有着重要的理论和实践意义。

目前，用于Abeta;斑块的分子探针成像方法主要有放射(PET)和荧光成像，已报道的放射成像分子探针有PIB、SB－13，但放射成像有辐射、成本高、操作复杂的缺点^[4]。与其相比，荧光分析法具有灵敏度高，选择性强，方法快捷，重现性好，取样容易，试样需样量少的优点，在化学生物方面应用广泛，主要用于生物化合物的定性定量和结构研究，且近红外( 600～900 nm) 荧光成像用于生物成像时具有组织自荧光干扰小、组织穿透力强的优点，具有巨大的应用潜能^[5]。但由于之前研究的Abeta;探针对Abeta;寡聚体的识别较弱甚至无法识别，所以开发新的特异性检测Abeta;寡聚体的小分子近红外荧光探针具有重要意义。

二、 研究目的

在具有Abeta;寡聚体选择性的PTO-29探针基础上，寻找针对Abeta;寡聚体的选择性更高的近红外成像探针。在前期工作的基础上^[6]，以Abeta;单体和Abeta;聚合物的结构差异为切入点，通过计算机药物设计辅助，设计、合成和筛选选择性结合可溶性Abeta;寡聚体的小分子近红（NIR）荧光探针，为新型AD检测和治疗试剂的开发提供全新的理论思路和研究基础。

三、 研究内容

1. 计算机药物设计

Abeta;三聚体是由三个U型发夹首尾相连形成环状的蛋白^[7]，其核心片段多暴露于寡聚体表面；而Abeta;斑块是非环状蛋白，其三维结构中存在着狭长的U型孔道，核心片段多暴露于孔道中。抗Abeta;抗体对可溶性和不溶性Abeta;s具有一定的选择性，其鉴别能力来源于Abeta;s的二级与三级结构的差异。这表明二级与三级结构之间的差异可以作为设计小分子探针以区分可溶性和不溶性Abeta;s^[8]。根据Abeta;寡聚体和Abeta;聚合物的结构差异，在CRANAD-3的基础上结合计算机模拟分子对接研究，设计了T型结构的CRANAD-102，可以特异性结合可溶性Abeta;蛋白。以三聚体作为寡聚体的研究模型，将CRANAD-102的T型结构改为V型结构得到PTO29,其对寡聚体的选择性增加而对单体的选择性减弱，验证了V型结构的对靶向寡聚体的可行性，因此以PTO29为先导化合物，对其进一步结构优化，提高其光学性质以及对于寡聚体的选择性等。

2. 合成路线设计

参考PTO-29的合成路线，结合基本理论知识和文献报道的方法，设计并理解目标化合物的合成路线。下面为PTO-29合成路线:

Reagents and conditions: (a) 1-ethyl-4-iodobenzene,K2CO3, Cul, L-Pro, DMSO, 90℃; (b)BF3, Et2O, tributyl borate, r.t. ; (c) tetrahydroisoquinoline,acetic acid, CH3CN, r.t.

3. 合成实验

合成目标化合物PTO-85~88，通过核磁共振氢谱、碳谱、高分辨质谱对其进行结构确证。

4. 性能测试

对制备的荧光探针进行荧光光谱测试和光学性质的考察，体外蛋白结合评价及Abeta;寡聚体靶向结合能力评价。

1). 荧光探针对Abeta;寡聚体的选择性

对比荧光探针与Abeta;寡聚体共孵育前后的发射波长的变化，研究探针对可溶和不可溶Abeta;寡聚体的选择性。

2).对Abeta;寡聚体亲和力检测

为考察探针与Abeta;的亲和力以及检测灵敏性，用不同浓度的Abeta;蛋白滴定探针溶液，测定探针与Abeta;寡聚体和聚合体结合的Kd值。

3).对Abeta;寡聚体靶向性检测（脑匀浆实验）

将探针分别与Abeta;单体、寡聚体和聚合体在野生型小鼠脑浆中共孵育30min，检测探针荧光强度变化。若与Abeta;寡聚体共孵育组荧光强度增强的程度比其他组大，则表明在生理环境下探针可以区分Abeta;寡聚体与单体和聚集物。

4).血脑屏障透过性实验及脑清除率实验

合格的荧光探针需要满足良好的光稳定性、亲脂性和易通过血脑屏障的要求。选用野生型小鼠，将探针静脉注射给小鼠，30min后提取脑组织。通过荧光光谱和MS结果显示，探针具有较强的抗氧化能力且能穿过BBB。萃取物通过HPLC测定，评价脑清除率。

5).血清稳定性和细胞毒性测定

血清稳定性好，细胞毒性低是理想探针的两个关键特性。在37℃下将探针与小鼠血浆孵育60min，用不同浓度SH-SY5Y细胞进行MTT法来测定细胞毒性。

6).在体成像

实验组为4月龄APP/PS1转基因小鼠，对照组为其余条件均相同的野生型小鼠。探针采用静脉注射方式给药，利用近红外小动物成像仪记录图像监测探针与 Abeta; 寡聚体在小鼠体内结合的情况，判断其选择性大小是否合适且能否用于检测体内成像。

四、 工作计划

2月25日～2月29日:确定选题，进行相关文献调研；

3月1日～3月20日:撰写开题报告；

3月21日～5月30日：合成路线设计、开展合成实验以及活性研究；

6月1日～6月12日：论文写作，论文答辩

参考文献

[1]D.J. Selkoe,Alzheimers disease: genes, proteins, and therapy, Physiol Rev, 81 (2001)741-766.

[2]张婷,张志荣,程妍.Abeta;斑块靶向近红外荧光探针的合成及评价[J].华西药学杂志,2019,34(04):320-324.

[3]张菁菁. 新型Abeta;诊断/治疗双重靶向小分子的研发[D].中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所),2019.

[4]Mathis CA, Wang Y, Holt DP, et al. Synthesis and evaluation of ¹¹C- labeled 6 - substituted 2 - arylbenzothiazoles as amyloid imaging agents［J］. J Med Chem, 2003,46 (13):2740-2754.

[5]荧光探针的应用[J]. 邹肇娥,王化远,唐元清. 华西药学杂志. 1991(04)

[6]J. Yang, F. Zeng, X. Li, C. Ran, Y. Xu, Y. Li, Highly specific detection ofAbeta oligomers in early Alzheimers disease by a near-infrared fluorescentprobe with a 'V-shaped' spatial conformation, Chem Commun (Camb),56 (2020) 583-586.

[7]A.G. Kreutzer, S. Yoo, R.K. Spencer, J.S. Nowick, Stabilization, Assembly,and Toxicity of Trimers Derived from Abeta, J Am Chem Soc, 139 (2017) 966-975.

[8]LiYuyan,Yang Jian,Liu Hongwu,Yang Jing,Du Lei,Feng Haiwei,Tian Yanli,CaoJianqin,Ran Chongzhao. Tuning the stereo-hindrance of a curcumin scaffold forthe selective imaging of the soluble forms of amyloid beta species.[J].Chemical science,2017,8(11).