开题报告内容：
一、研究背景
在临床输血治疗中，一些疾病病毒常常会通过输血途径传染引发，故保障输血治疗安全具有重要的意义。HBV、HCV、HIV等病毒是临床常见的通过血液传播感染的病毒，常规检测方法（如酶联免疫法）存在窗口期过长和病毒变异等现象，有较大漏检的风险，给输血安全带来巨大威胁。核酸检测技术(Nucleic acid testing, NAT)可直接检测病原体核酸，明显缩短血液病毒检测窗口期并能检测出因病毒变异而漏检的血液，显著提高输血安全。
NAT主要原理是将病毒核酸直接扩增或其附带的信号放大后，转变成直观的光电或可视信号，继而判断相应的病原体是否存在于标本中，检测步骤包括核酸的提取、扩增和检测。方法主要有PCR(Polymerase chain reaction) 扩增和转录介导的扩增技术(TMA, Transcription-mediated amplification)。PCR 是在体外模拟自然 DNA 半保留复制过程的 NAT 技术，具有灵敏度和特异性高等特点；Taq DNA 聚合酶( Taq DNA polymerase) 的使用实现了 PCR 技术自动化检测。TMA 可以RNA 为模板，在约 42 °C 等温反应条件下利用 RNA聚合酶和逆转录酶进行扩增，产物为 RNA。
当前，针对血液病毒的PCR（包括荧光定量PCR）检测技术已在国内外得到应用，然而血液病毒种类繁多，荧光定量PCR检测技术由于荧光相互干扰很难做到高通量检测，多重PCR 检测技术虽然通量高，但其扩增产物需要通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，不仅操作繁琐，需要电泳设备，而且很难区分与目的条带大小接近的非特异性扩增产物。针对以上不足，本研究拟采用多重PCR结合核酸侵入(Invader)反应结合纳米金显色技术建立了一种针对血液病毒的检测新方法，可对HBV、HCV、HIV、TP四种血液病毒同时进行检测，以期为血液病毒的快速鉴定提供一种灵敏、特异、高效的方法。
二、研究方法
本研究拟建立多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色的检测新方法。
PCR的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。它是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得所需的大量的特定基因片段。
核酸侵入反应是针对待测核酸模板，设计一对上下游探针，使这对探针与模板杂交后，形成上游探针 3rsquo; 端一个碱基侵入到下游探针与模板杂交双链中的侵入结构，FEN 酶识别这种侵入结构，并将下游探针 5rsquo; 区域与模板不互补的flap 片段连同被侵入的碱基切割下来。在设计上下游探针时，将上游探针的熔解温度（Tm）设定在较反应温度高 5~6°C，而下游探针的 Tm 值接近反应温度。这样，在反应过程中，上游探针会牢固地与模板杂交形成双链，而下游探针在被切割后会与模板解离，新的完整的下游探针会再次与模板杂交形成侵入结构，引发再一次的切割；经过一定的反应时间，形成 flap 片段的积累，由此完成了对待测模板的第 1 次信号放大，将待测模板转化为具有特异性核酸序列的 flap 寡核苷酸片段（信号分子）。
纳米金显色是利用核酸纳米金探针，将寡核苷酸片段修饰在纳米金表面而形成的纳米颗粒，表面的寡核苷酸片段可与待测靶核酸进行特异性杂交，使纳米金颗粒发生聚集，从而导致纳米粒子光散射性质发生改变，造成肉眼可见的颜色变化。本研究设计发夹探针的两端能够捕获涂覆在纳米金表面的探针，当发夹探针完整时，纳米金探针被连接，引起纳米金探针的聚集。因为一个纳米金探针可以捕获多个发夹探针，每个发夹探针又可以与另一个纳米金探针杂交，纳米金探针的聚集体变得越来越大，并最终在反应管中形成沉淀。当靶基因存在于被切割的flap片段时，发夹探针被切割成两个DNA区段。每个区段结合一个纳米金探针，致使纳米金探针在溶液中游离，溶液显示红色。与基于杂交诱导的纳米金探针聚集的常规显色不同，本试验中的阳性指示是红色，而非紫色。与从红色到紫色的颜色变化相比，肉眼对从无色（沉淀）中识别红色更敏感。
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