开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)
一、课题的研究背景、意义和目的
随着人们生活水平的提高,糖脂代谢的各种问题成为危害健康的社会普遍性疾病。聚多肽融合蛋白PsTag648-FGF21作为一种长效FGF21分子,为糖脂代谢相关疾病新型药物的开发奠定了基础。
聚多肽PsTag由Ala、Gly、Pro、Ser、Thr五种氨基酸组成。其特点包括无规则卷曲结构、不带电荷、无免疫原性等,与FGF21融合表达,聚多肽融合蛋白很好的保留了全部的生物活性,并且由于其能明显延长半衰期,在体内的疗效显著优于原型FGF21。
前期研究中,通过CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌细胞外膜或细胞壁相关基因,筛选获得大肠杆菌渗漏表达菌株Delta;palDelta;mrcADelta;tolA作为表达PsTag648-FGF21的工程菌株,通过胞外分泌的形式获得更高产量的PsTag648-FGF21蛋白分子,并通过目的蛋白的捕获、粗纯、精纯三步基本纯化步骤,摸索并开发胞外分泌的融合蛋白PsTag648-FGF21的纯化工艺。
在聚多肽融合蛋白PsTag648-FGF21的生产纯化工艺中,Q柱粗纯产品进行CM柱精纯前,需要进行缓冲溶液的置换,可以通过大体积稀释或透析实现。由于透析用时过长,以及缓冲溶液pH值在透析过程中会越过蛋白质的等电点,会导致蛋白质沉淀,我们拟采用超滤方式先对样品进行浓缩,再通过大体积稀释实现缓冲溶液的置换。此外,在最终蛋白样品保存时,也需要对样品进行超滤浓缩。
立足于此,本课题拟采取切向流过滤系统对聚多肽融合蛋白PsTag648-FGF21进行分离、浓缩。考虑到蛋白自身稳定性,通过对超滤操作压力、操作温度、蛋白样品浓度等操作参数对聚多肽融合蛋白PsTag648-FGF21超滤过程的影响进行研究,优化超滤参数。通过单因素试验和响应面试验,以超滤通量、超滤回收率、超滤前后蛋白稳定性作为主要检测指标,确定较为合适的超滤条件。希望通过对超滤影响因素的研究,得到膜分离的最佳条件,同时保证蛋白的稳定性。以期开发稳定的纯化工艺,为胞外分泌生产PsTag聚多肽融合FGF21蛋白的大规模生产提供基础。
二、课题研究的主要内容
1.超滤装置参数、结果评价指标、影响因素的确定
1.1超滤装置相关参数的了解
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