天然产物A对光动力学治疗的协同作用文献综述

1. 选题意义及研究目的：

光动力学治疗（photodynamic therapy；PDT）一般采用静脉注射（也可以口服）的方法使光敏药物（如血卟啉衍生物；hematoporphyrin derivative，HpD）进入血液之中，通过血液循环作用把光敏药物输送到人体的各个器官和组织。由于病变组织对光敏药物具有很强的亲和能力，所以经过一段时间后，正常组织中的光敏药物已经通过肝﹑肾排出体外，而病变组织中的光敏药物仍然存在，这时如果用某些适当的短波长的光进行照射，残留在病变组织中的光敏药物会发生光致敏化反应而发出红色荧光，这种现象在临床上被用于癌症的诊断。如果用某些适当的较长波长的光进行照射，残留在病变组织中的光敏药物会发生光致敏化反应而产生生物毒性物质，从而破坏病变组织中的微血管，造成局部缺血和病变细胞的死亡，达到治疗癌症的目的。

随着临床PDT的不断应用，人们逐渐发现其短期内疗效比较确切，但仍有可能出现肿瘤复发，而且由于光敏剂在组织内分布不均匀﹑激光穿透能力有限等因素的影响，PDT对深部及较大体积的实体瘤疗效不佳，因此需要积极寻找使PDT增效的其他途径。目前，使PDT增效的途径有：①PDT联合传统治疗方法，如外科手术﹑化疗药物﹑放射治疗﹑高压氧疗以及温热治疗等方法；②靶向治疗，即提高光敏剂的选择性，如将光敏剂与某些单克隆抗体或配体耦联形成光敏剂免疫共轭物﹑与低密度脂蛋白或脂质体结合等；③PDT结合基因治疗，即通过基因转染的方法，是癌细胞表达某种对PDT损伤更为敏感的基因，以增强PDT疗效；④PDT与其他药物联合应用，如维拉帕米﹑依地酸钙二钠﹑葡萄糖或阿米洛利等；⑤通过其他途径，如抑制PDT后基因产物的表达或抑制PDT后细胞损伤的修复等。

关于PDT的作用机制及增效手段等理论研究正在不断发展，光敏剂和激光器的类型也在不断研发。本次课题旨在于研究天然产物A是否对光动力学治疗具有协同作用及其作用机制，从而使PDT增效以更为安全有效地应用于临床治疗肿瘤患者。

1. 研究背景及国内外发展概况：

在过去一个世纪，人类对光动力学治疗的研究取得了重大突破，其主要研究里程有：

1903年Herman vonTappeiner和A. Jesionek首用PDT治疗癌症（皮肤癌）。

1911年W. Hausmann做血卟啉动物实验。

1913年Friedrich Meyer–Betz第一次用卟啉做人类实验。

1955年Samuel Schwartz发展出血卟啉衍生物（HPD），光敏毒性为血卟啉2倍。

1960年Richard Lipson和Baldes描述了HPD在肿瘤中的积累和对肿瘤的光电探测法。

1972年Diamond研究了血卟啉抗神经胶质瘤的体内、体外实验。

1975年Thomas Dougherty用PDT成功治疗一名皮肤癌患者。J.F. Kelly使用HPD成功治疗小鼠膀胱癌。同年，ThomasDougherty与同事报道使用HPD联合红光做到完全清除小鼠内肿瘤（乳腺癌）。

1978年Dougherty实施第一个临床PDT研究。

1984年后爆发性研究开始。

1999年第一个PDT药物在加拿大通过批准。

目前，许多研究主要致力于新型光敏剂和新型药物载体的研发。今年有研究尝试将PDT应用与新的疾病治疗。迄今，大多数PDT案例仍然是经其他标准治疗无效的﹑不同分歧的各种肿瘤的病人，而且光敏剂剂量﹑光照时间和光照剂量等治疗参数也常是无法相互比较的。一项新的发展是把PDT作为治疗性外科的一种辅助疗法，用以杀灭手术无法切除干净的瘤床肿瘤细胞，从而降低复发率。

影响PDT功效的一些重要因素包括光敏剂类型﹑剂量与给药途径；给药与光照的时间间隔；照光剂量﹑激发光波长及照光方式；组织类型及氧合作用等。目前的研究方向是了解这些因素的各自作用，明确某些治疗应用中的最适治疗参数。

1. 研究内容：

探究天然产物A是否对光敏剂原卟啉（Protoporphyrin IX；PpIX）的光动力学治疗具有协同增效作用。

1. 研究方法：
2. 通过MTT比色法分别测定天然产物A与光敏剂原卟啉（PpIX）对人皮肤鳞癌细胞（A-431）的半数抑制浓度（IC₅₀），再测定二者混合后联用对人皮肤鳞癌细胞（A-431）的半数抑制浓度（IC₅₀），最后计算其协同指数。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540 或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
3. 采用流式细胞术（FCM），通过测定在有无天然产物A存在的两种情况下，人皮肤鳞癌细胞（A-431）在光敏剂原卟啉（PpIX）杀伤中的死细胞比例，从而验证天然产物A是否对光敏剂原卟啉（Protoporphyrin IX；PpIX）的光动力学治疗具有协同增效作用。流式细胞术（FCM），通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况，死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，利用荧光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放线菌素D（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料，从而测定死细胞比例。
4. 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（TUNEL），通过测定在有无天然产物A存在的两种情况下，人皮肤鳞癌细胞（A-431）在光敏剂原卟啉（PpIX）杀伤中的死细胞比例，从而验证天然产物A是否对光敏剂原卟啉（Protoporphyrin IX；PpIX）的光动力学治疗具有协同增效作用。TUNEL法，也称DNA 断裂的原位末端标记法，这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3rsquo;-OH进行原位标记，借助一种可观测的标记物，如荧光素，能对凋亡细胞的核DNA中产生的3rsquo;-OH 末端进行原位标记，用荧光显微镜即可进行观察。
5. 采用蛋白质印迹法（Western Blotting），通过测定凋亡相关蛋白的含量以确定在有无天然产物A存在的两种情况下，人皮肤鳞癌细胞（A-431）在光敏剂原卟啉（PpIX）杀伤中的死亡程度，从而验证天然产物A是否对光敏剂原卟啉（Protoporphyrin IX；PpIX）的光动力学治疗具有协同增效作用。Western Blotting采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

论文工作实施计划

起止日期

工作内容和要求

2016.02.22-2016.03.25

通过MTT比色法分别测定天然产物A与光敏剂原卟啉（PpIX）对人皮肤鳞癌细胞（A-431）的半数抑制浓度（IC₅₀），再测定二者混合后联用对人皮肤鳞癌细胞（A-431）的半数抑制浓度（IC₅₀），最后计算其协同指数。

2016.03.25-2016.04.15

采用流式细胞术（FCM），通过测定在有无天然产物A存在的两种情况下，人皮肤鳞癌细胞（A-431）在光敏剂原卟啉（PpIX）杀伤中的死细胞比例，从而验证天然产物A是否对光敏剂原卟啉（Protoporphyrin IX；PpIX）的光动力学治疗具有协同增效作用。

2016.04.16-2016.04.30

采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（TUNEL），通过测定在有无天然产物A存在的两种情况下，人皮肤鳞癌细胞（A-431）在光敏剂原卟啉（PpIX）杀伤中的死细胞比例，从而验证天然产物A是否对光敏剂原卟啉（Protoporphyrin IX；PpIX）的光动力学治疗具有协同增效作用。

2016.05.01-2016.05.15

采用蛋白质印迹法（Western Blotting），通过测定凋亡相关蛋白的含量以确定在有无天然产物A存在的两种情况下，人皮肤鳞癌细胞（A-431）在光敏剂原卟啉（PpIX）杀伤中的死亡程度，从而验证天然产物A是否对光敏剂原卟啉（Protoporphyrin IX；PpIX）的光动力学治疗具有协同增效作用。

2016.05.16-2016.05.27

数据处理及毕业论文撰写