开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、研究背景
主要组织相容性复合物-I类相关链A(Major histocompatibility complex class I-related chain A,MICA) 基因位于人第6号染色体的MIC-I类区域中，具有高度多态性，其编码的MICA分子表达在内皮细胞表面。MICA分子是高度糖基化的单次跨膜蛋白,通过与NKG2D （Natural killing cells receptor G2D，NKG2D）受体结合实现生物学功能。NKG2D是NK细胞活化性受体，MICA分子与NKG2D结合后不仅能激活NK细胞和T细胞毒性作用，分泌大量细胞因子及细胞毒介质，杀伤靶细胞；而且能促使B细胞产生相应MICA抗体，参与体液免疫应答。MICA蛋白是肿瘤相关抗原,在上皮性肿瘤,如肺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌等细胞表面高表达，然而肿瘤细胞往往会水解脱落表面的MICA蛋白逃逸系统的免疫监视。研究已经证实MICA蛋白的胞外区是由alpha;1-alpha;3结构域组成，其中alpha;1-alpha;2结构域与NKG2D结合激活NK细胞，而alpha;3结构域存在蛋白水解脱落位点。在构建融合蛋白药物时，需要考虑可溶性MICA蛋白胞外全长和alpha;1-alpha;2结构域对于结合NKG2D激活NK细胞是否存在差异性，以便获得最佳的抗肿瘤作用。
本课题旨在利用实验室已有MICA基因片段，采用HEK293T表达系统，构建重组表达载体pcDNA3.1-MICA（alpha;1-alpha;3）和pcDNA3.1-MICA（alpha;1-alpha;2），再利用脂质体瞬时转染HEK 293T细胞进行目的蛋白的表达并对表达产物进行镍柱亲和层析纯化、Western blot鉴定。得到所需的稳定表达的两个人重组MICA蛋白分子，建立MICA蛋白真核表达系统并为需要MICA蛋白分子的实验提供蛋白来源。
二、实验内容
蛋白表达载体的构建
pcDNA3.1-MICA（alpha;1-alpha;3）和pcDNA3.1-MICA（alpha;1-alpha;2）
设计MICA基因PCR引物，将人源MICA信号肽基因片段与MICA基因片段连接，并添加His-tag便于蛋白纯化。上游与下游的酶切位点分别为EcoRI和NotI。用EcoRI酶和NotI酶对PCR电泳切胶回收产物和表达载体pcDNA3.1进行双酶切，将目的基因整合入表达载体中。
1.2氯化钙制备E.coli DH5alpha;感受态
采用钙离子诱导制备大肠杆菌感受态。
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