课题背景
Talpha;1是胸腺内分泌细胞和胸腺上皮细胞所产生的一种高度保守的多肽，广泛存在于哺乳动物、昆虫、真菌和原生生物的组织细胞中，它们蛋白质的结构是一样的。胸腺素alpha;1是一种免疫增强剂，作用于T淋巴细胞，能诱导和促进胸腺细胞的分化和成熟，并且促进胸腺内骨髓干细胞转化为T淋巴细胞，然后进一步分化为T细胞不同功能的亚群，增加CD4 和CD8 T细胞的产生。具有较高的免疫增强活性和对血管内皮细胞迁移的刺激作用、促进血管生成和伤口愈合等作用，临床应用主要用于治疗免疫缺陷和免疫受抑制的疾病，例如对乙肝、丙肝、恶性肿瘤、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病及慢性感染的治疗。
目前 Ta1 可从三种途径中获得:一种是从小牛胸腺中获得,此方法成本较低,但是具有步骤繁琐、产量低以及引入外源性的抗原的缺点; 另一种是利用化学合成的方法得到,此方法具有简单、高效、纯度高等优点,临床上应用的 Ta1 即是此种方法获得的,但是此方法生产的 Tal 成本高,普通患者难以承受;第三种是用基因工程的手段表达, 此方法成本低、效率高, 但是获得的 Ta1 的纯度还达不到临床应用的要求。由于 Tal 的分子量小, 易被细胞中的蛋白酶降解,故 Ta1 通常和融合标签融合表达。大肠杆菌表达的Talpha;1，与天然的Talpha;l的氨基酸组成相同，但是N端缺少乙酰化修饰。对于 Talpha;l体外生物学活性有着大量的研究，结果表明 N端是否有乙酰化修饰，对 Talpha;l生物活性影响并不显著。因此如何通过基因工程方法获得可在临床上推广的胸腺肽alpha;1，成为目前研究的焦点。考虑到小分子肽的表达通常会比较困难，我们采用了融合表达方式，构建了胸腺肽alpha;1的融合表达载体。在此基础上，将重组质粒转入大肠杆菌，构建工程菌，对工程菌进行发酵培养并进行Talpha;1的分离和纯化。胸腺肽alpha;1分子中不含半胱氨酸，因此无二硫键，无糖基化。本课题通过利用IPTG诱导大肠杆菌表达重组Talpha;1-抗体融合蛋白，得到可溶性的目的蛋白上，并通过镍柱纯化出目的蛋白，然后通过对小鼠的体内实验对重组Talpha;1-抗体融合蛋白的抗肿瘤活性进行研究。
作用机制
1． 1免疫调节作用 (1)诱导和促进胸腺细胞的分化和成熟： Ted可促进胸腺内的骨髓干细胞转化为T淋巴细胞并进一步分化为T细胞不同的功能亚群，这是Ted最基本的调节作用。(2)刺激干细胞增殖并增加NK细胞、CD 4、CD 8 T 细胞的产生：将Ted加入骨髓干细胞与胸腺上皮共同培养时，可增加CD 4 T细胞的数量及IL-7的产量(胸腺生 成素的刺激因子)。在大鼠结、直肠癌中， Ted 和 IL． 2能够逆转化疗后受抑制的CD4 T细胞数量。Ted增强患者体内CD 3、C D4和CD 8 T细胞的产物，特别是CHB和癌症患者，以及甲型流感病毒感染小鼠和应用皮质醇后免疫功能受抑制的小鼠。在多个动物模型， 实验者和HIV感染的患者中，还发现Ted 具有增强N K细胞活性的作用，在病毒感染性疾病中十分重要。(3)在肿瘤坏死因子 (TNF)存在或不存在的条件下， Ted可促进骨髓来源的树突状细胞(DC)成熟分化并增强其功能，而 DC直接影响T细胞的成熟和分化。研究表明Ted不但促进表达CD4的树突状细胞的分化并活化其标志分子，而且能促进CD4的表达并提高由TNF.诱导的成熟标志分子的上调水平。(4)Ted增加T hl细胞因子的产生：Ted 可增加IFN-1、IL-2 及IL- 3 的产生，通过丝裂原或抗原的激活增加IL-2受体的表达。Thl反应伴随着显著的抗病毒反应， Th2 反应则伴随着病毒感染的持续和免疫逃逸。在C HC的治疗中，Ted 可增加病毒阳性患者外周血单个核细胞(PBMC)中Thl细胞亚群和IL- 2 的产生。(5)调节海马神经元突触传递的作用：胸腺内皮产生的胸腺激素除了具有免疫调节作用外，还活跃于神经系统及内皮周围。有研究报道，摘除了胸腺的小鼠在认知能力和记忆上有所衰退，提示胸腺激素对认知过程和神经系统功能有调节作用。还有研究表明，鼠的中枢神经系统特定神经丛可表达Ted，激活由蛋白激酶A (PKA )和蛋白激酶C(PKC)调节的几种信号传导通路，激活有丝分裂原活化的蛋白激酶 (p42／44MAPK )，从而活化骨髓干细胞来源的巨噬细胞。(6)减少T细胞凋亡： Ted 可对抗地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡，降低地塞米松或抗 CD3抗体诱导的荷瘤小鼠中 T细胞的凋亡，其机制可能与增加 PKC和cAMP，增加抗凋亡的bcl-2基因和减少前凋亡蛋白基因bax、bad和fas的表达有关。
- 2抗病毒作用 (1)增加M HC.I类分子的表达：病毒感染的细胞或肿瘤细胞减少MHC．I 类分子的表达，故可逃逸免疫系统的监视。在培养细胞中加入Totl可增加MHC—I类分子的表达，从而提高免疫系统对肿瘤细胞识别的功能，识别MHC—I类分子表达缺陷的细胞。Ted增加免疫识别受染细胞的机制可能与NFKB的抗凋亡、IL一2产量的增加和谷胱甘肽的效应等相关。(2)抑制病毒复制：在治疗CHB的动物实验中， Tot l可显著降低循环血中病毒的量。实验还表明，与安慰剂相比较，Tot l能降低肝细胞癌的发病率。此外Ted还可抑制培养的多种非小细胞肺癌细胞系的生长，抑制体内肿瘤细胞的生长，防止小鼠肺腺瘤和大鼠乳腺癌的发生。
1．3 调节基因表达 通过基因芯片技术从人PBMC中提取出的mRNA的分析发现， Tot l 不仅可以诱导MAP激酶级联基因(MAP-kinase cascade genes)，上调细胞因子基因 (IFN 一、NGF-1 3) ， MHC—I和MHC-1 I类分子相关基因，而且还能上调一系列的免疫反应调节基 因(如MIG，MCP-3，RANTES，SDF一1，DC — CK 1， STC P-1， ENA-78 等)， 3种不同的Toil样受体基因，I L一18，整合素-B5，IL一15 受体和粒酶A基因等 ，提示了Totl有刺激抗原递呈细胞的作用。而IL- 7、干细胞生长因子和造血蛋白1基因表达的上调则提示了其在免疫细胞生长中的作用。这些新的发现都在蛋白质水平运用不同方法得以证明，它们将有助于进一步揭示Totl的作用机制。
实验流程
- 重组Talpha;1-抗体融合蛋白的制备
菌种活化→种子液培养→发酵培养→超声破碎→纯化蛋白→SDS-PAGE检测蛋白表达和纯化→脱盐、冻干保藏
- 重组Talpha;1-抗体融合蛋白的活性研究
动物分组→免疫缺陷模型的建立及给药→解剖→结果分析
预期结果
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