开题报告内容：
- 研究目的与意义
癌症是威胁人类健康的五大杀手之一，其作为严重威胁到人们的生命健康安全的疾病而引起人们的广泛关注。近几十年来，新的抗癌药物开发都将焦点放在靶向癌细胞的特异遗传缺陷上。这些药物往往起初起效，但很快就会出现耐药，主要是受到癌症中肿瘤自身高度异质性、遗传网络的适应性以及高度体细胞突变频率的限制，在总体上仍无法取代化疗和放疗，因此寻找抗癌治疗的新概念或新策略已成为当今研究人员的重要课题。
本实验主要是建立在癌细胞代谢发生改变，导致核苷酸构件氧化这一基础上。实验所得的MTH1能够清除由活性氧自由基（ROS）所氧化损伤的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP），阻止了这种氧化应激掺入到DNA中，成为DNA损伤[1]。这确保了癌细胞的复制过程，使得它们能够进行分裂和增殖。因此使用MTH1抑制剂，抑制MTH1功能，增加细胞毒性，致使细胞凋亡从而有效地杀灭肿瘤细胞。值得注意的是正常细胞不需要MTH1，他们可以通过新陈代谢阻止这种氧化应激[2]。因此抑制MTH1可以作为抗癌治疗的方法新策略，它可能会解决肿瘤自身的异质性并且更广泛地应用于不同的肿瘤治疗。
- 国内外研究现状
早在1998年，科学家就发现MTH1能有效地清除核苷酸池中被氧化的碱基[3]，再进一步研究发现MTH1参与多种恶性肿瘤的发生与发展过程，如胃癌，结肠癌，卵巢癌等[4]。MTH1还可以预防小鼠神经细胞的致突变性和细胞毒性[5]到了2014年，该项研究有了突破性的进展，MTH1在正常细胞中是非必需蛋白，而它又保护癌细胞DNA复制过程免受干扰，因此它可能与异常生长的癌细胞的发生与发展密切相关[6]。更重要的是，MTH1是癌症普遍依赖的一种蛋白，并且这种蛋白酶活性似乎与存在于特定癌症中的遗传改变相互独立。即MTH1抑制剂可以作用于多种肿瘤细胞，抑制他们生长与迁移。
随着研究的深入，研究人员发现了多种对MTH1有较好抑制功能的抑制剂，如TH287，TH588，S型crizotinib以及SCH51344等。在临床试验中，人们发现MTH1抑制剂对所有当前治疗产生耐药的黑色素瘤患者的肿瘤治疗反应良好，而且相关研究成果证实以往鉴别的一些杀死癌细胞的物质也是通过抑制MTH1酶来起作用[2]。
目前国内对于MTH1的相关研究也取得相关进展。研究发现缺氧诱导因子1（HIF1）能够促进人类结肠直肠癌中MTH1的表达[7]。另外，在胃癌中，细胞质的8—oxo—Gsn和MTH1的表达情况也与其病理分级情况相关[8]。
- 研究方法和手段
1、MTH1原核表达载体构建
NCBI基因库里查找MTH1 mRNA序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司优化密码子，克隆至pET-28a表达载体上，转化感受态大肠杆菌。挑选阳性表达菌株，kana抗生素筛选阳性克隆，挑取阳性克隆接种入液体LB培养基使其大量扩增（37℃培养12h），进行质粒小提并测序检测序列正确性。
2、MTH1原核表达条件摸索
MTH1蛋白的表达量受表达条件的限制，摸索最适IPTG浓度，最适诱导时间，最适表达温度以及确定表达形式。测序认证后将生长较好的表达菌株接种于5mL LB培养基（含 50mu;g/mL Kan）中，37℃，200rpm过夜培养。取50mu;L过夜培养液，按1：100比例转接到新的5mL LB液体培养基（含100mu;g/mL Kan）中，转培养2h时左右，至OD600达到0.4-0.6，取出1 mL菌液作为对照，剩余部分加入IPTG至终浓度为0.4mM进行诱导，降温到16℃，160 rpm/min振摇培养10h、13h、16h，SDS-PAGE比较表达量高低，摸索最适表达条件。
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