开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
肺炎支原体是侵入人呼吸道的重要病原体,其感染广泛存在于世界各地。它能引起咽炎、支气管炎,尤以婴幼儿肺炎常见,有时也可能会引起其他系统的并发症,如脑膜炎、心肌炎、心包炎、肾炎和免疫性溶血性贫血等疾病。
培养分泌肺炎支原体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，检测单克隆抗体的表达水平。小鼠腹腔注射液体石蜡，增强免疫水平。收集培养的杂交瘤细胞，洗涤后组射到小鼠腹腔内，根据腹水产生情况收集腹水，检测抗体的效价及浓度，利用离子交换层析等技术纯化单克隆抗体，并进行纯度及活性分析
实验室采用肺炎支原体国际标准株(Mycoplasma ,FH),经培养增殖和浓缩提纯后,采用多途径免疫BALB/c小鼠,末次免疫第4d取脾细胞。在PEG-1000作用下,与小鼠骨髓瘤细胞(SPZ/0-Agl4)融合,上清液抗体检测采用间接免疫荧光法(IFA),抗原片段制备系用本实验室培养的FH株菌落,通过水浴加热脱去琼脂,固定在10孔的镀膜玻片上,获得阳性细胞孔后,再用有限稀释法进行细胞克隆2一3次,共筛选出5株分泌抗肺炎支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞,免疫球蛋白类型分别为IgG1,IgG2a和IgG2b。
课题的意义
目前虽然国外已采用单克隆抗体酶标记免疫吸附测定法(ELISA)和金标来作病原学诊断,但国内病原学诊断仍主要采用分离培养和常规血清学试验,这些方法花费时间长,灵敏度不够高。研制国产抗人肺炎支原体种特异性单克隆抗体,将有助于对肺炎支原体感染进行早期快速诊断,对指导临床和合理用药有重要意义。
国外已应用肺炎支原体单克隆抗体以ELISA和金标的方法检测肺炎支原体抗原,对肺炎支原体的早期诊断有重要意义。由于尚无国产肺炎支原体单克隆抗体,一般都采用分离培养的方法检测和鉴定肺炎支原体。此方法虽特异性强,但时间过长(10～ 15 d),且灵敏度不高,对临床诊断与治疗帮助不大。另一方面常规血清学检查主要是检测多克隆抗体,此方法虽然简便快速,但特异性不高,容易有交叉反应,且达不到早期诊断的目的。所以研制国产化种特异性肺炎支原体单克隆抗体可以提高诊断的灵敏度和特异度,能达到早期诊断的目的,具有重要的临床意义。
拟研究或解决的问题（研究内容）
制备特异性强的单克隆抗体,抗原的选择是关键。肺炎支原体的抗原成分有糖脂和蛋白质,糖脂抗原具有非专一性,制备的单克隆抗体特异性差;膜抗原的特异性较好。本次试验选择43kDa膜蛋白抗原免疫动物制备的单克隆抗体具有很强的特异性,特别是和生殖支原体没有交叉反应,解决了肺炎支原体P1蛋白和膜结合蛋白制备的单克隆抗体与生殖支原体存在交叉反应的问题。
1.抗原制备:将肺炎支原体接种于支原体生长培养液中,37℃密闭培养2一3天,待培养液中的酚红由红转黄时,将培养液离心并收集菌体,经PBS三次洗涤后,用NS制成百倍浓缩抗原,超声裂解五次,每次2分钟。使支原体细胞充分破裂。.将此裂解液s000rPm离心1小时,上清液主要为支原体细胞内含物抗原,沉淀主要为支原体细胞膜抗原。
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